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湖北省梨地方资源遗传变异和亲缘关系SSR分析 　　摘要：采用9对SSR特异性引物对湖北省92个梨品种（类型）的遗传变异和亲缘关系进行了分析。结果表明，9对引物共扩增出71个等位基因，不同引物扩增的等位基因差异较大，从5个到12个不等，平均每个位点7.9个等位基因。位点杂合度在0.616～0.868之间，平均值为0.788；Shannon-Weaver指数在1.690 2～2.964 4 之间。采用UPGMA聚类分析法构建的系统树将92个梨品种划分为5组：白梨组、砂梨组、杂交类、豆梨组和半野生组。SSR分析结果说明湖北省梨地方资源具有丰富的遗传多样性和复杂的亲缘关系。 　　关键词：梨；种质资源；遗传变异；亲缘关系；SSR；湖北省 　　中图分类号：S661.2；S-3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5496-06 　　湖北省是中国梨属（Pyrus L.）植物的主要原产地之一，也是砂梨的重要产地。由于湖北省内自然条件和生态条件复杂多样，地貌类型多，加之梨属植物种间没有杂交障碍，在长期的自然演变和栽培驯化过程中，形成了极为丰富的地方品种、栽培类型和野生变异类型。据不完全统计，湖北省梨地方品种和栽培类型的数量超过300个。国家果树种质武昌砂梨圃共收集保存了92份湖北省梨地方资源，从形态学上鉴别这些资源可能存在同名异物、同物异名现象，且品种之间的遗传背景和亲缘关系至今仍不清楚，在一定程度上限制了湖北省梨种质资源的认识和利用。 　　以PCR为基础的分子标记技术的出现为梨品种鉴定、亲缘关系等遗传分析提供了有力的手段[1]。SSR（Simple sequence repeat）标记因其丰富的多态性、共显性遗传、重复性好和操作简便等优点日益受到重视，也适合梨品种的遗传分析[2，3]。Kimura等[4]采用9对SSR引物分析了60个梨品种和类型的遗传多样性，同时鉴别出2个同物异名和2个同名异物品种。Brini等[5]利用SSR引物对25份突尼斯地方梨品种进行了遗传多样性分析，为这些地方品种的保存提供了理论依据。Bao等[6]利用SSR标记对98份东亚梨品种进行了亲缘关系和遗传多样性研究；路娟等[7]采用25对SSR引物对不同系统的150份梨资源进行了系统分析。 　　本研究利用SSR标记技术分析了湖北省梨地方资源的遗传变异和亲缘关系，为湖北省梨??植物资源的进一步搜集、保存、开发利用和遗传育种提供科学指导，从而为湖北省梨种质资源保护和利用提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试92份梨种质资源来自湖北省农业科学院果树茶叶研究所的国家果树种质武昌砂梨圃。材料编号、品种名称及来源地见表1。92份材料原产地来自于12个县（市），其中兴山27份、荆门20份、武汉8份、罗田7份、咸丰7份、远安6份、巴东4份、长阳4份、建始3份、宣恩3份、利川2份、鹤峰1份。来源地经度分布为108°93′E-115°39′E，纬度分布为29°68′N-31°23′N。 　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA提取 摘取春季萌发的梨嫩叶，采用改良的CTAB法提取DNA[8，9]，并结合供试材料及试验条件略作改进。提取结束后，用分光光度计测定DNA浓度并将其调整为10 μg/μL。 　　1.2.2 PCR反应体系 所用9对SSR引物均为多态性好且分辨率高的引物，由上海英骏生物工程技术服务有限公司合成。其中1、2号引物是Liebhard等[10]在苹果上开发的，3～9号引物是Yamamoto等[11]在梨属植物上开发的。具体引物序列见表2。 　　参考Yamamoto等[12]、Gianfranceschi等[13]的方法，优化后的PCR反应体系总体积为20.0 μL，其中包括模板DNA 2.0 μL、引物2×0.4 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，dNTP 0.4 μL，PCR Buffer 2.0 μL，ddH2O 14.6 μL。 　　引物CH01F02、CH01H10扩增程序为：94 ℃预变性2.5 min； 94 ℃变性0.5 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。引物NH004a、NH005b、NH008b、NH009b、NH011b、NH015a、NH017a扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。 　　1.2.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测 PCR产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，采用AgNO3染色法进行染色[14]。 　　1.2.4 数据统计与分析 根据DNA条带位置的不同，以“1”