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铁皮石斛内生细菌分离和初步鉴定 　　摘要： 以野生药用植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为研究对象，采用无菌操作技术分离到内生细菌23株，其中来源于根、茎、叶的分别为7株、8株、8株。通过形态学观察和染色等，初步鉴定了铁皮石斛内生细菌具有7个属，包括土壤杆菌属（Agrobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、泛菌属（Pantoea）、乳杆菌属（Lactobacillus）、梭菌属（Clostridium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）。研究丰富了我国细菌资源，为铁皮石斛内生菌资源的开发利用提供了理论依据。 　　关键词：铁皮石斛；内生细菌；分离；鉴定 　　中图分类号：Q93-331 文献标识码： A 文章编号：0439-8114（2013）08-1811-03 　　铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属药用植物，主要分布在我国云南、浙江、广西、贵州等地区。铁皮石斛具有抗肿瘤、抗辐射、抗血小板凝集、增强机体免疫力等功效，是我国传统的名贵中草药[1]。随着需求量的日益增加，野生铁皮石斛被无序采集，自然资源日趋减少，部分种类已濒临灭绝。植物内生菌作为一种重要的微生物资源，是植物微生态系统的重要组成部分，也是新型天然活性物质的重要来源之一[2]。然而，在我国药用植物开发和利用中，对内生菌的研究相对较少，目前已研究涉及的药用植物内生菌只有300余种，这相对于我国丰富的药用植物资源（11 146种）还相差很远。因此，开展我国药用植物内生菌研究，特别是其生物多样性和化学多样性研究是非常必要的。目前，关于铁皮石斛内生菌多样性的研究已有报道[3-6]，但仅限于其内生真菌的研究。研究采用形态学鉴定方法，系统分离铁皮石斛内生细菌，为丰富我国细菌资源和促进铁皮石斛保护性开发利用提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物来源 新鲜健康野生铁皮石斛于2011年10月采自浙江天台山，保持整棵植株的完整性带回实验室，4 ℃保存，24 h内处理。 　　1.1.2 培养基 NA培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，氯化钠5 g，琼脂16 g，去离子水1 000 mL；分离培养基：每毫升NA培养基中加入100 IU两性霉素B，用于内生细菌分离纯化。NB培养基：??肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，氯化钠5 g，去离子水1 000 mL；半固体培养基：牛肉膏1.8 g，蛋白胨4 g，葡萄糖20 g，酵母浸出液1.3 g，NaCl 3 g，Na2HPO4 1 g，MgCl2 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，琼脂为5 g，去离子水1 000 mL，用于穿刺培养[7]。 　　1.2 方法 　　1.2.1 内生细菌的分离纯化 铁皮石斛植株用清水冲洗干净后，选取适量根、茎、叶，在75%乙醇中浸泡30 s，再置于2%次氯酸钠中5～10 min（根和茎消毒10 min，叶消毒6 min），用无菌水冲洗4次后，在无菌条件下将根和茎切为0.5 cm长的小段，叶切为0.5 cm × 0.5 cm的小片。选取根、茎、叶各10小段（片）作为铁皮石斛供试组织材料接入分离培养基中，在37 ℃培养箱中恒温培养7 d。每天定时检查内生细菌长出情况，及时挑取切口处新长出的细菌菌落，并转移到NA培养基中，纯化培养直至获得单一纯菌株。最后，将获得的纯菌株转接到NA培养基，37 ℃培养箱中培养10 d，供观察鉴定和保藏。同时，用最后一次漂洗供试材料的无菌水涂布于分离培养基平板上作为对照，同样条件下培养观察，确保样品表面彻底消毒，保证分离到的菌株确实是内生细菌[8-10]。 　　1.2.2 内生细菌的初步鉴定 内生细菌的初步鉴定参照文献[11，12]的方法进行。 　　1）菌落形态观察。将纯菌株接到NA培养基中培养，每天定时观察，记录每个菌落的大小、形状、颜色、含水状态、菌落透明度、边缘情况以及菌落形成速度等，同时观察记录液体培养过程中菌落性状，观察其在试管中的生长部位，得出其对氧的需求情况。 　　2）革兰氏染色。取干净载玻片，滴一滴去离子水，用接种针挑取菌龄为20 h的菌苔少许，均匀涂布在载玻片上，风干固定；用含结晶紫的混合染液染色约1 min后水洗；碘液作用约1 min水洗，吸干；用95%乙醇或丙酮乙醇溶液脱色至无色（约30 s）；用番红液染色5～6 min后水洗，风干；镜检。 　　3）荚膜染色。采用湿墨水法进行荚膜染色，菌龄72 h，操作步骤为：加一滴墨水于洁净的载玻片上，挑取少量菌体与其混合均匀；盖上盖玻片，取一张滤纸放