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第二章 PCR技术的原理及应用;故事发生在1983年的春夏之交;Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…...;Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……;Mullis的第一个PCR实验;;The Thermus aquaticus DNA polymerase Taq Not permanently destroyed at 94oC Optimal temperature is 72oC;耐高温DNA聚合酶的种类;PCR仪器的变迁;PCR的发展史;PCR不只是一个方法改进;PCR相关的术语和产品层出不穷; ;（二）PCR的种类1.普通PCR;PCR;PCR具有极高的灵敏度;（二）PCR的种类 2.RT-PCR：反转录PCR(reverse transcriptase-PCR) 原理：RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 特点：作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物(GSP)中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 应用：RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，分析基因的转录水平，细胞中RNA病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNA序列。;两步法RT-PCR示意图;两步法RT-PCR;EcoRI;cDNA序列的克隆;（二）PCR的种类 2.Nested PCR：巢式PCR 原理：利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点：由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5RACE）的特异性。 应用：一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。;Nested PCR原理示意图;（二）PCR???种类 3.Inverse PCR：反向PCR 原理：用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。 优点：可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。 应用：一般应用于未知序列的扩增，有时也用于定点突变。;Inverse PCR原理示意图;（二）PCR的种类;PCR-RFLP原理示意图;5.PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性(single strand conformation polymorphism) 原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。 特点：刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型。 优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。;PCR-SSCP示意图;从定性到定量的革命; 聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。;PCR产物生成