副溶血弧菌热激亚致死损伤与显微红外光谱检测.docVIP

副溶血弧菌热激亚致死损伤与显微红外光谱检测 　　摘要[HTSS]采用传统的平板计数法作为对照，利用显微红外光谱技术（4000-400 cm 　　Symbolm@@ 1）并结合化学计量学，研究了在55 ℃水浴中热激处理不同时间（0， 2， 4， 6和8 min）对副溶血弧菌失活和亚致死损伤的作用效果。二维主成分分析（PCA）表明，正常细菌与受损细菌能够各自聚类，明显区分，而且损伤程度不同的细菌也能够基本区分。载荷图分析（LPA）发现，加热处理后，副溶血弧菌中的多糖、结构蛋白、脂质、核酸都发生了变化，其细胞壁、细胞膜和DNA皆遭受损伤。类模拟软独立建模（SIMCA）的结果表明，一般情况下，受不同程度热损伤的细菌均有80%以上的预测率，能够被有效区别开。研究表明，显微红外光谱技术具有检测热激后亚致死损伤的副溶血弧菌的潜力。 　　[KH*3/4D][HTH]关键词[HTSS]显微红外光谱技术；副溶血弧菌；亚致死；热激 　　[HK][FQ（32，X，DY-W][CD15稿受 　　本文系国家863项目（No. 2012AA101601）、国家科技支撑计划项目（No. 2012BAD29B02）、国家自然科学基金项目（No.和上海市科委长三角科技联合攻关项目（No. 11495810600）联合资助 　　* Email： xmshi@sjtu.edu.cn 　　1引言 　　副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水产品中引起食物中毒的重要病原菌之一[1]，在海产品中的携带率高达45.7%，在我国部分沿海地区，由副溶血弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件中居首位[2]。副溶血弧菌对热较敏感，一般在56 ℃处理5 -10 min即可被杀死。经加热、冷冻、脱水等处理后，细菌或被杀死，或无损存活下来，还有一些可能受到了亚致死性损伤[3]。在适当条件下，受损细菌可以修复损伤并恢复包括毒力和繁殖能力在内的所有生理活性，仍然具有致病性，严重威胁人类健康。因此，检测亚致死损伤的副溶血弧菌对于食品安全监控具有重要意义。然而，用传统的平板方法检测受损细菌工作量大，检测周期长[4]，往往需耗费3-5 d或更长的时间。 　　红外光谱技术在微生物检测中的应用兴起于20世纪90年代，具有操作简单、分析速度快、成本低、应用范围广等优点。红外光谱能够提供整个有机体的指纹图谱，反映细胞的???化组成。红外光谱技术在微生物分类与鉴定、生物膜的研究、抗生素的研究等方面都得到广泛应用[5]。2004年，Lin等将其应用于细菌亚致死损伤的检测[6，7]。然而，目前大多文献都采用普通红外技术，尚未见利用红外光谱技术研究副溶血弧菌亚致死损伤的报道。 　　本研究采用显微红外光谱技术研究副溶血弧菌的亚致死损伤，其灵敏度更高，制样更简单，检测时间更短。结合化学计量学分析，采用主成分分析（PCA）鉴别区分不同程度损伤的细菌，并用类模拟软独立建模（SIMCA）验证PCA模型的有效性；同时，采用传统的平板计数法进行验证；用LPA找出细菌受损后发生改变的组成和结构，探讨细菌受损机制。本研究建立了快速有效的检测亚致死损伤副溶血弧菌的方法，同时探讨了食品加工过程中细菌细胞化学组成的变化和细菌灭活的机制，为改进现有的杀菌方法和技术提供理论基础。 　　2实验部分 　　2.1仪器、试剂与材料 　　Nicolet iN10 MX显微红外光谱仪（ThermoFisher，USA，带液氮冷却的MCT检测器）。 　　非选择性培养基：含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、含3% NaCl的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）；选择性培养基：硫代硫酸盐柠檬酸盐胆汁盐蔗糖（TCBS）琼脂；生理盐水（0.9% NaCl）；最大修复稀释液（0.1% 蛋白胨水）。 　　2.2供试菌株与热处理培养液的制备 　　副溶血弧菌ATCC 17802（中国普通微生物菌种保藏管理中心）保存于 　　Symbolm@@ 80 ℃冰箱中，用40 mL胰蛋白胨大豆肉汤活化，37 ℃ 下175 r/min过夜振荡培养至稳定期；再将少量菌液涂布于TCBS平板，37 ℃ 培养16 h；挑取单菌落，接种于200 mL 胰蛋白胨大豆肉汤中，37 ℃ 下175 r/min过夜振荡培养至稳定期。各取10 mL 菌液分别加入15个50 mL 离心管中，4000 r/min 离心4 min 收集菌体。为消除代谢产物和培养基对细菌红外谱图的影响，将细胞用10 mL 无菌生理盐水重复洗涤两次后，重新悬浮于5 mL 生理盐水中，制得热处理培养液。 　　2.3热激实验 　　将1个热处理培养液作为空白对照，另外4个装有5 mL 热处理培养液的离心管同时浸入5