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蛋白质组学技术及其在植物逆境生物学中应用 　　摘要：逆境胁迫是制约植物生长发育、影响作物产量和质量的关键因子，揭示植物应答胁迫的分子机理一直是人们长期探索的重大课题。植物的蛋白质组学研究可以系统揭示不同胁迫条件下植物蛋白质的表达状况，从而深入了解环境胁迫下植物的基因表达调控机制、植物响应胁迫机理。简要介绍了蛋白质组学的研究技术，概述了其在植物逆境胁迫适应机制研究中的应用，并对蛋白质组学在该领域的发展前景进行了展望。 　　关键词：蛋白质组学；非生物胁迫；生物胁迫；双向电泳；质谱 　　中图分类号：Q946.1；Q945.78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5403-06 　　随着生命科学的日益发展，对基因功能的研究已不仅仅局限在核酸水平。蛋白质是基因功能的执行者，是生命现象的直接体现者。要深入了解生命的复杂活动，就需要从蛋白质的整体水平上进行研究。蛋白质组学是指研究蛋白质组的科学，本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于组织变化、细胞代谢等过程的整体而全面的认识[1]。近些年来，蛋白质组学发展迅速，并得到了广泛的应用，成为生命科学研究的核心内容之一。 　　植物在生长发育过程中会遭遇高（低）温、干旱、水涝和高盐等非生物胁迫以及病原菌侵染和虫害等生物胁迫。植物感受逆境信号后，可以通过信号转导调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，从而调整自身的生理状态或形态来提高对逆境的耐受能力。在蛋白水平，对发生变化的蛋白质进行定性和定量测定，探讨植物在逆境胁迫条件下的调控机制，是研究植物抗逆性的重要手段之一，并已在多种植物的研究中取得了一定的成果。 　　1 蛋白质组学研究技术 　　过去，许多科学家都致力于蛋白质组的大规模定性分析，而现在，如何系统地识别和定量一个蛋白质组则是蛋白质组学研究的主要目的之一[2]。由于蛋白质的浓度在很大程度上影响了其功能的实现，因此，对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量也就变得至关重要。目前，比较成熟的蛋白质定量方法主要分为两类???一类基于传统双向凝胶电泳及染色，另一类基于质谱检测技术。 　　1.1 基于凝胶的定量蛋白质组学技术 　　双向电泳（Two dimensional electrophoresis，2DE）技术是由O’Farrell于20世纪70年代建立的[3]，具有高分辨率的特点，通常能分辨出1 000～3 000个蛋白点[4]。该技术自诞生以来，一直在不断改进和优化。目前，应用比较广泛的双向电泳技术主要是双向荧光差异凝胶电泳（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）。但双向电泳本身也存在着一些弊端：试验重复性差；对蛋白质的分离受到蛋白丰度、等电点、相对分子质量和疏水性等的限制；自动化程度低；操作起来费时费力等，这些都在一定程度上限制了该技术的应用。 　　1.2 基于质谱的定量蛋白质组学技术 　　基于质谱的蛋白质组学定量技术可以分为两大类：标记定量技术（Labeling quantitation）和非标记定量技术（Label-free quantitation）[2]。此外，标记或非标记的鸟枪蛋白质组学策略也是基于质谱技术的常用方法。 　　1.2.1 标记定量技术 　　1.2.1.1 同位素代谢标记法 　　同位素代谢标记以同位素元素或同位素标记氨基酸形式掺入到细胞培养基中，在细胞生长代谢过程中完成蛋白质同位素标记。此方法的显著优点是蛋白质在样品制备的初期被标记，由此减少了试验操作造成的误差，从而提高了准确度。目前比较常用的方法包括15N体内代谢标记和细胞培养中稳定同位素标记氨基酸（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）方法。 　　1）15N体内代谢标记法。采用含有15N（或14N）作为惟一氮源的培养基来培养植物组织（植株），依靠掺入合成蛋白质的15N实现定量[5]。这项技术适用于多种蛋白提取物的蛋白质定量，包括那些需要进行大量纯化步骤、蛋白产量易发生改变的[6]。其优势还在于可应用于水培植物，使得植物对养分的吸收得到更好的控制。 　　2）SILAC方法。依靠在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸（如赖氨酸或精氨酸等）实现对蛋白质的定量，已经广泛用于高等动物细胞蛋白质的鉴定及定量[5]。SILAC法标记效率高、损失小；标记误差低，可靠性高。然而，由于植物细胞本身可以合成这些必需氨基酸，导致只有部分蛋白质被标记。并且，此方法成本较高，导致其在植物蛋白质组学研究中的应用受到了一定的限制。 　　1.