蜡样芽孢杆菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病效果及机理研究.docVIP

蜡样芽孢杆菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病效果及机理研究 　　摘要：试验研究蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）CGMCC4348菌株对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）的生物防治效果，并初步探讨其抑菌机理，以寻找防治番茄灰霉病的新方法。试验从定量生物测定、室内离体抑菌试验和盆栽试验3个方面考察其抑菌作用效果，并以硫酸铵分级沉淀法提取拮抗蛋白进行检测。结果表明，室内抑菌试验的EC50为6.19 mg/L；盆栽试验中处理3对番茄灰霉病的平均防效达75.80%，与50 mg/L嘧霉胺处理的防效相当。试验证明蜡样芽孢杆菌CGMCC4348对番茄灰霉病菌有较好防治效果。 　　关键词：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）；生物防治；CGMCC4348 　　中图分类号：S436.3；S476.19 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1817-04 　　灰霉病可侵染200多种植物的花、果实及其他绿色组织[1，2]，导致组织腐烂，丧失利用价值。近年来中国蔬菜灰霉病发生面积逐年增加，成为蔬菜生产的一大障碍[3]。其中茄科蔬菜以番茄受害最重，一般发病田块番茄灰霉病造成的产量损失为20%～40%，重病田块达60%以上[4]。 　　长期以来生产上主要依靠化学农药防治灰霉病，病原菌对常用化学药剂极易产生抗药性，且长期依赖和大量使用化学农药会带来环境污染和食品安全等问题[5-7]。多种真菌、细菌对灰霉病菌均有一定的抑制作用[8]，如木霉、粘帚霉、酵母菌、假单胞杆菌等，近年利用生防菌成为植物灰霉病防治的新策略。作者在番茄病害生物防治研究中筛选到1株可有效抑制番茄灰霉病菌（灰葡萄孢菌，Botrytis cinerea）的生防菌株，经鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），命名为CGMCC4348[9，10]。本研究以室内抑菌试验与盆栽防效试验结合的方式来探讨该生防菌对灰霉病的防治效果，并提取有效拮抗蛋白进一步探索其抑菌机理，以期为设施茄果类蔬菜病害绿色防控技术提供科学依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 供试菌株 　　生防菌：蜡样芽孢杆菌CGMCC4348，南京工业大学生物与制药工程学院实验室分离和保存，发酵培养基为YPG培养液[11]，菌种活化与保存采用营养琼脂培养基[12]。 　　番茄灰霉病病原菌：灰葡萄孢菌，江苏省农业科学院植物保护研究所生物防治实验室分离和保存，采用PDA培养基[13]培养。 　　1.2 定量生物测定 　　将番茄灰霉病菌在PDA平板上活化，25 ℃培养待用；活化后的蜡样芽孢杆菌CGMCC4348于YPG培养液中28 ℃、140 r/min振荡培养36 h。 　　定量生物测定采用平板对峙法，将蜡样芽孢杆菌菌液稀释成不同的浓度梯度，每浓度处理重复5次，以无菌液体培养基作为对照，计算菌丝生长抑制率[14]。数据处理采用DPS软件[15]，建立浓度对数—抑制百分率机率值毒力回归方程式，计算抑制中浓度（EC50）。 　　1.3 离体抑菌试验 　　取新鲜番茄苗第三、第四片真叶，用无菌水洗净，置于装有湿滤纸的培养皿中，打孔器打取灰霉菌菌饼，无菌条件下接于叶片之上。对照，只接灰霉病菌；处理1，接入灰霉病菌36 h后以喷雾方式接入1 mL生防菌发酵液；处理2，喷雾接入1 mL生防菌发酵液后接入生防菌，24 h后接入灰霉病菌。每处理重复5次。培养皿置于人工气候箱中，温度28 ℃，光照12 h/d，相对湿度60%。70 h后观察抑菌效果。 　　1.4 盆栽防效试验 　　将无菌条件下萌发的番茄种子（品种为日本美玉）播于土壤（自然土∶营养土∶蛭石为5∶4∶1）中，温室育苗，当番茄苗长出4片真叶时盆钵单株移栽。以无菌水洗下番茄灰霉病菌分生孢子，制成4×106个孢子/mL浓度的灰霉孢子悬浮液，以喷雾的方式均匀接种于番茄叶部10 mL，灌根10 mL。生防菌稀释至1×106 CFU/mL，以喷雾方式接种10 mL于叶片上。各处理如下：对照，只接种灰霉孢子液，后续清水处理；处理1，同时进行灰霉孢子液和生防菌液处理；处理2，灰霉孢子液处理 2 d后，接种生防菌液；处理3，生防菌液连续处理2 d后，接种灰霉孢子液；处理4，灰霉孢子液处理后喷雾50 mg/L嘧霉胺10 mL。每处理60盆，温室培养。温室温度20～25 ℃、相对湿度80%～90%。采用文献[16]方法统计病情指数及防效。病情分级的根据是叶片病斑面积占整个叶面积的百分比，0级，无病斑；1级，≤5%；3级，5%～10%；5级，10%～20%；7级，20%～50%；9级，≥50%。 　　1.5 抑菌作用机理试验 　　1.5.1 拮抗蛋白的提取 蜡