假丝酵母高产SOD菌株筛选.docVIP

假丝酵母高产SOD菌株筛选 　　摘要：超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC1.15.1.1，简称SOD）是广泛存在于生物体的一种十分重要的金属酶，因其对机体所具有的较高防护与保健价值而深受人们的关注。目前SOD主要来源于动物血液，资源有限。试验从微生物中提取SOD，通过分离、鉴定为假丝酵母（Candida glaebosa）。对假丝酵母的四个生长条件，即生长温度、接种量、初糖浓度和培养基的pH进行优化，从而得出产SOD的最优生长条件，即菌种在初糖浓度为50 g/L，pH为5.8的培养基中，接种3 mL，在26 ℃生长3 d所得的菌体具有最高的产SOD能力。 　　关键词：假丝酵母（Candida glaebosa）；高产；SOD；筛选 　　中图分类号：Q939.97 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5466-04 　　超氧化物歧化酶（SOD）是广泛存在于生物体内，具有防御氧化损伤（抗氧化）作用的一类金属酶[1]。研究表明，从微生物中提取主要得到Fe-SOD，Mn-SOD，但有的微生物含有不同类型SOD，如酵母菌既有Cu/Zn-SOD，又含有Mn-SOD；大肠杆菌则含有3种SOD[2]。目前SOD临床上主要用于治疗糖尿病、白内障、风湿性关节炎、慢性多发性关节炎，而且还能抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗辐射、抗自身免疫疾病，是很有临床价值的药用酶。此外，SOD对治疗贝切特氏病、心肌梗塞等血管性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合征、水肿、肺气肿、辐射病以及老年白内障等疾病也有疗效[3]。在中国，SOD研究和应用的深度及广度早几年前就已居酶类生化制剂的首位[4]。 　　近几年来国内外在微生物SOD的菌种选育、发酵工艺、生理学机理、基因重组的研究及SOD的应用方面都获得了一定的进展。由于纯化SOD的工艺十分的复杂，成本较高，而用有益微生物发酵生产的SOD有可能不经过传统的纯化工艺直接用于食品及化妆品，还可以直接用于乳制品发酵，生产功能性食品及微生物制剂。因此，随着微生物SOD的研究及SOD应用基础研究的进一步深入，其在医疗保健、食品、化妆品等方面会有更加广泛的应用。酵母菌作为生产SOD的材料来源之一，具有繁殖快，代谢时间短，产率高，易培养，易大规模工业化生产，不受季节与自然条件的限制等优点[5]。本试验研究了从假丝酵母（Candida glaebosa）中筛选高产SOD菌株的方法，以期为实现微生物法生产SOD提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 菌种 　　实验菌种从华中农业大学菊园、葡萄园、栀子花园中采集土样，通过分离获得。 　　1.2 培养基 　　1.2.1 酵母富集液 葡萄糖 5%，尿素0.1%，（NH4）2SO4 0.1%，KH2PO4 0.25%，Na2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，FeSO4·H2O 0.01%，酵母膏0.05%，孟加拉红0.003%，pH 4.5。 　　1.2.2 氮源基础培养基 KH2PO4 1.36 g，CaCl2·2H2O 0.005 g，Na2HPO4 2.13 g，MgSO4 ·7H2O 0.2 g，FeSO4·H2O 0.2 g，葡萄糖10 g，蒸馏水1 000 mL。 　　1.2.3 碳源基础培养基 （NH4）2SO4 2 g，MgSO4 ·7H2O 0.2 g，NaH2PO4 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO4 0.5 g，蒸馏水1 000 mL。 　　以上3种培养基均用蒸馏水配制，然后121 ℃灭菌20 min。 　　1.2.4 发酵基础培养基 配料：黄豆芽200 g，水1 000 mL；制法：将豆芽洗净，放入水中煮沸30 min，用纱布过滤。 　　1.2.5 马铃薯葡萄糖液体培养基（固体另加1.5%～2.0%的琼脂） 配料：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，自来水1 000 mL，pH自然；制法：马铃薯去皮，切成小块，加水煮软，用纱布过滤后加入糖和琼脂，融化后补足水分，然后在121 ℃下灭菌20 min。 　　1.3 仪器与药品 　　1.3.1 仪器 Leica DME显微系统，上海莱卡显微系统有限公司；恒温摇床、超净工作台，哈尔滨市东联公司；卧式圆形压力蒸汽灭菌锅，上海华成医用核子仪器有限公司；调速多用振荡器，国华电器有限公司；UV-754型分光光度计，苏州江东精密仪器有限公司；ESJ60-4型电子分析天平，沈阳天平仪器有限公司。 　　1.3.2 药品 葡萄糖、D-木糖、乳糖、鼠李糖、麦芽糖、棉子糖、半乳糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇、异丙醇均为分析纯，上海化学试剂总厂；磷酸氢二钾，分析纯，天津市北联化学试剂厂；硝酸钾，分析