高级生化试验紫外分光光法的应用.pptVIP

(3) 图计算法----两组分吸收光谱完全重叠--混合样品测定 (3)图中，a,b 吸收光谱双向重迭，互相干扰，在最大波长处互相吸收。处理方法如下： 1. 解线性方程组法 过程： 2. 等吸收双波长法- 注：须满足两个基本条件 选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点 选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大 使用注意点 1.开机前将样品室内的干燥剂取出，仪器自检过程中禁止打开样品室盖。 2.测定紫外波长时，需选用石英比色皿。 3. 使用的比色皿必须洁净，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无溶剂残留，切勿用手捏透光面，并注意配对使用，比色皿放入样品室时应注意方向相同。量瓶、移液吸管均应校正、洗净后使用。 4.比色皿内溶液以皿高的2/3～4/5为宜，不可过满以防液体溢出腐蚀仪器。使用挥发性溶液时应加盖。 5. 供试品溶液浓度除各该品种已有注明外，其吸收度以在0.3～0.7之间为宜。 6.测定时除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm石英吸收池，在规定的吸收峰±2nm以内，测几个点的吸收度或由仪器在规定的波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸收度最大的波长作为测定波长，除另有规定外吸收度最大波长应在该品种项下规定的测定波长±2nm以内。 7.测定时，禁止将试剂或液体物质放在仪器的表面上，如有溶液溢出或其它原因将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净。 8.如果仪器不能初始化，关机重启；如不成功，请向管理老师反映。 9.如果吸收值异常，依次检查：波长设置是否正确（重新调整波长，并重新调零）、测量时是否调零（如被误操作，重新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波段时，要用石英比色皿）、样品准备是否有误（如有误，重新准备样品）。 使用注意点 10.供试品应取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应取2份。平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内。? 11.实验结束后将比色皿中的溶液倒尽，然后用蒸馏水或有机溶剂冲洗比色皿至干净，倒立晾干。关电源将干燥剂放入样品室内，盖上防尘罩，做好使用登记，得到管理老师认可方可离开。 使用注意点 分光光度计原理 721单束分光光度计 754c可见分光光度计使用 * 紫外分光光度法的应用 一、物质对光的选择性吸收 ●物质的颜色由物质与光的相互作用方式决定。 ●人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：400~760nm。 ●让白光通过棱镜，能色散出红、橙、黄、绿、蓝、紫等各色光。 ●单色光：单一波长的光 ●复合光：由不同波长的光组合而成的光，如白光。 ●光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定比例混合得到白光， 称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。 物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收而产生。  即物质的颜色是它所吸收光的互补色。 无色溶液：透过所有颜色的光 有色溶液：透过光的颜色 黑色： 吸收所有颜色的光 白色： 反射所有颜色的光 物质的本色 完全吸收 完全透过 吸收黄光 光谱示意 表观现象示意 复合光 蓝光 无色 黑色 物质的颜色与光的关系 基于物质吸收紫外或可见光引起分子中价电子跃迁、产生分子吸收光谱与物质组分之间的关系建立起来的分析方法，称为紫外可见分光光度法（UV-vis）。 二、紫外-可见分光光度法 （1）灵敏度高，可测到10-7g/ml。 （2）准确度好，相对误差为1%-5%，满足微量组分测定要求。 （3）选择性好，多种组分共存，无需分离直接测定某物质。 （4）操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单、便宜。 （5）应用广泛，无机、有机物均可测定。 紫外-可见分光光度法的基本原理 一、透光率（透光度）和吸收度 ①透光率T 定义： T 取值为0.0 % ~ 100.0 % T = 0.0 % ： 光全吸收 T = 100.0 % ：光全透过 ②吸光度（吸收度）A T= It I0 ×100% 显然，T↑，溶液吸收度↓；T ↓，溶液吸收度↑。 即透光率T反映溶液对光吸收程度，通常用1/T反映吸光度。 定义： A = lg 1 T = -lgT = lg I0 It A=-lgT , T=10-A t I0 = It + Ia + Ir 吸收光 反射光 透过光 Ia ③T与A关系： Ir A∝1/T，T=0，A=∞ ，T=100%，A=0 二、光的吸收定律 　朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1760年和1852年研究吸光度Ａ与溶液厚度Ｌ和其浓度Ｃ的定量关系： 朗伯定律： A=k1 ×L 比尔定律： A=k1 ×C A=k C L 　一束平行单色光通过一均匀、非散射的吸光物质溶液时，在