少突胶质前体细胞对脊髓伤治疗作用实验研究.docVIP

少突胶质前体细胞对脊髓伤治疗作用实验研究 　　摘要：采用Allens重物撞击法建立小鼠SCI模型，致小鼠脊髓损伤。体外分离、培养和纯化GFP转基因鼠的OPCs。同时，对OPCs进行诱导分化。通过眶静脉将OPCs移植到脊髓损伤模型鼠体内。体外实验证明分离、培养并纯化的OPCs具有自我增殖的能力，并且可以分化为少突胶质细胞。移植后的OPCs不仅可以与宿主脊髓组织较好的整合，并可迁移到损伤部位，替代损伤组织。 　　1.材料与方法. 　　1.1材料 　　主要试剂为DMEM/F12（1：1）培养基，bFGF、PDGF。胰蛋白酶、胎牛血清、胎盘蓝染液、硫瑾染液、EDTA、多聚赖氨酸。抗体A2B5、O4、Cy3、Alax488、DAPI和PI。C57BL/6小鼠，B6C3-Tg（EGFP）加强型绿色荧光蛋白转基因。 　　1.2方法 　　皮层混合细胞培养：在解剖显微镜下，取0～2d新生的B6C3-Tg（EGFP）绿色荧光蛋白转基因小鼠，断头后迅速取出鼠脑，清除脑膜，分离双侧大脑皮质，置于预冷的D-Hanks液中漂洗2次，转入含无血清DMEM/F12培养液的离心管内，用巴氏吸管反复吹打至组织块基本消失，200目不锈钢筛网过滤，取滤液以1500rpm， 离心5min。收集沉淀，加入完全培养液（DMEM/F12、10%FBS、1%双抗）1ml，用吸管吹打制成细胞悬液，计数后接种T-75培养瓶中，密度为2×105/ml。37℃ 5%CO2条件下培养，以后每2～3d换液1次。 　　胚胎OPCs的分离和纯化：原代培养至9～11d时，根据培养体系内星形胶质细胞融合及细胞分层情况进行振荡分离。振荡前，更换新鲜的基本培养基孵育24 h，将培养瓶转移至恒温振荡器上进行初步振荡处理（220rpm，37℃，30min）。弃掉旧培养基，用无菌PBS清洗培养瓶3次，加入新鲜基础培养基8-10ml/瓶，转入培养箱继续孵育1h，再次将培养瓶置于恒温振荡器上进行过夜振荡处理（300rpm，37℃，4～6h）。收集振荡后细胞悬液并离心（1200 rpm，4℃，lOmin）。用2～3ml基本培养基重新悬浮细胞，将其接种于未包被多聚赖氨酸的培养皿内，入培养箱孵育20-30min。再取悬液并离心（1200rpm，4℃， 5min）可去除大部分星形胶质细胞和成纤维细胞。用1～2ml0PCs培养基重新悬浮细胞，接种于包被多聚赖氨酸的培养瓶上，前两天进行1 /3量换液。培养5d后， 弃去培养基， 加入少许DMEM /F12清洗1次， ???去细胞碎片； 加入0.25% 的胰酶消化15～20sec后立即加入血清终止消化，在倒置显微镜下观察， 如仍有较多细胞贴壁可将培养瓶水平放置在脱色摇床上慢速摇晃1～2min， 吸取细胞悬液置于培养皿中，20min后收集细胞悬液并离心，弃上清液， 用OPCs完全清培养基重悬细胞接种于多聚赖氨酸预处理的培养瓶中，转入细胞培养箱中继续培养。 　　小鼠脊髓损伤模型建立及分组：根据Allens等的重物撞击法建立SCI小鼠模型。成年C57BL/6小鼠32只，体重16～18g，随机分为4组，即模型组、假手术组、细胞移植组和细胞液移植组，每组8只。模型制作与Allens的方法基本一致，但略有变动。在26℃下，将麻醉后小鼠，俯卧于手术台上，根据棘突的体表定位确定手术切口后，将手术区域剪毛备皮处理，用碘伏、70%酒精彻底消毒皮肤。取背部正中切口，逐层切开皮肤、皮下组织、筋膜。沿棘突向两侧剥离棘旁肌，充分显露T8-T12棘突及相应椎板。咬除T9-T11棘突，切除T10全椎板，充分暴露相应脊髓节段。以5.0g，0.5mm/sec的致伤速率打击脊髓造成小鼠SCI。造模成功后逐层缝合切口。 　　OPCs的移植：在模型制备后的第7天行细胞移植，其中细胞移植组给予OPCs移植治疗，细胞液移植组给予培养基注射治疗，模型组和假手术组不做任何处理。细胞计数后将其浓度调整为5×l06细胞/10μL/只。将小鼠麻醉、固定，右手持微量注射器，沿右眼或左眼眶下壁，以45°角刺入，刺入深度约2～3mm，若遇阻力稍后退调整角度后再刺入，缓慢将细胞悬液推入眶后静脉丛。留针2分钟后缓慢拔针。 　　行为学判定： 实验采用常用Basso，Beattie and Bresnahan（BBB）运动功能评分观察研究OPCs移植术后小鼠后肢运动功能的恢复情况。将小鼠后肢运动功能分为22（0-21）个等级，完全性瘫痪为0分，功能正常常为21分。观察时将受试动物置于lm2的空旷、不滑的平面场地上，使其适应场地活动。然后连续观察4min自由活动。 　　免疫细胞化学染色：分别将纯化后的OPCs用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定20分钟，进行A2B5免疫细胞化学检测。 　　取材：分别于术后7d，14d和