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第三章 细胞生物学研究方法 Chapter 3 Techniques in Cell Biology 第一节 显微技术 细胞生物学的建立和发展得益于光学显微镜的发明； 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能的研究达到了新的水平。 光学显微镜与电子显微镜的主要差别在所使用的光源不同，但分辨率却相差非常大： 光学显微镜的最大分辨率：0.2μm 电子显微镜的分辨率：0.2nm 一、显微镜的成像原理 所有类型的显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素： 1、照明系统； 2、被观察的物品； 3、聚焦成像的透镜系统 照明系统的波长是显微镜成像的重要因素，因为波长能决定被检测物体的最小极限，波长越长，波幅的跨度就越大，所能观察到物体的极限就越大。 1、分辨率（Resolution） 是指能分辨出相邻两个物点间的最小距离的能力。 一般规定：显微镜或人眼在25cm明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，称分辨率。 分辨力可用公式计算： R=0.61λ /N.A. N.A.＝ｎsinα 式中： λ =波长；n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口张角的1/2），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于90?，sin α 的最大值小于1。 2、最大分辨率 R值越小，分辨率越高，即需要λ尽可能地小，和N.A.尽可能大。 可见光中以蓝光波长最短， λ=450nm； 目前最好的玻璃透镜的α=70 ? ， sin α =0.94; 空气的折射率n≈1； 所以光镜的最大分辨率： R=450/1*0.94=292nm=0.3μm 3、分辨极限与放大率 显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限。 最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率（magnification）。 总放大率=物镜的放大率*目镜放大率 放大率受分辨极限的限制。一般，光学显微镜的最大放大率只能是数值孔镜（N.A.）的1000倍。 二、光学显微镜 （一）、普通双目显微镜 *照明系统：可见光源 *光学放大系统：由物镜和目镜组成，都是由玻璃透镜组构成；在物镜上方装有4个棱镜，使物镜的光线平分为两路到达目镜 *机械和支架系统：保证光学系统的准确配制和灵活调控 1. The Light Microscopy（LM） 2、倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，普通显微镜在载物台之下，倒置显微镜在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 3、暗视野显微镜（dark field microscope） 聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 能观察 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 4、荧光显微镜 是对能发荧光的物质进行定性和定量研究的工具。 细胞中有些物质如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光； 有些物质本身虽不能发荧光，但用荧光染料染色，紫外线照射也发荧光。 荧光显微镜和普通显微镜区别： 1、照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2、光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3、有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。 5、激光共聚焦扫描显微境（laser confocal scanning microscope） *用激光作光源，逐点、逐行、逐面扫描成像，激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 *调焦一次，扫描限制在样品一个平面。调焦深度不一时，可获样品不同层次图像，经计算机模拟，能显示样品的立体结构。 *激光波长短，光束细，分辨率是光镜的3倍。 6、相差显微镜（phase-contrast microscope） 由Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。 最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差（明暗差），从而提高了各种结构间的对比度，使结构变得清晰可见。 光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ，如再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。 构造上，相差显微镜不同于光镜之处： 1、环形光阑（annular? diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2、相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁