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茶树EST序列中微卫星标记特征分析及应用 　　摘要：从NCBI数据库中获得47 913条茶树（Camellia sinensis）EST序列，通过Cd-hit-est除去冗余序列后得到26 185条非冗余序列，利用Misa软件分析后共发现8 244个微卫星标记分布于6 283条EST序列中，平均相隔1.52 kb出现 1个 SSR，EST-SSR序列出现频率为23. 99%。其中，单、二和三核苷酸重复为主导类型，占 EST-SSR 总数的 97.83%。A/T、AG/CT和AAG/CTT作为单、二和三核苷酸的优势重复基元，分别占所属类型的92.99%、85.11%和26.99%。利用 Primer 5.0软件，设计了76对引物进行多态性检测，发现其中59对引物可以扩增出明显的条带，34对引物具有多态性，多态性比率高达57.63%，表明茶树 EST-SSR中的多态性位点比较丰富，比较适合进行大规模的 EST-SSR多态性标记的筛选。 　　关键词：茶树（Camellia sinensis）；EST-SSR；分布特征 　　中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）24-6178-04 　　微卫星DNA又称简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR），是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复构成的一段DNA序列。与其他分子标记相比，微卫星DNA多态性高、数量丰富并重复性好，而且具有遗传共显性、对基因组有很好的覆盖性和操作简便等特点[1-3]。根据SSR标记来源的序列性质不同，SSR标记可分为基因组SSR（Genomic SSR，gSSR）和表达序列标签SSR（Expressed sequence tag SSR，EST-SSR）两种。gSSR标记是来源于整个基因组的，而EST-SSR标记则来源于基因组的转录区域即表达区，可以直接反映功能基因的多态性，为功能基因的直接鉴定提供了可能性，具有通用性更高的优点[4]。我国是茶树（Camellia sinensis）的原产地，茶树也是我国目前非常重要的经济作物。截至2013年5月，在GeneBank中可获得47 913条茶树EST序列， 相比2010年5月时，增加了3倍[5]。基于茶树EST序列信息的快速扩增，本研究对已有的茶树EST序列中SSR信息进行了全面的发掘，对其组成、特征及分布进行了分析，同时设计了76对EST-SSR引物，并对19份茶树样品材料进行了多态性分析，从而开发了可以用于茶树的EST-SSR标记，为开发新的茶树功能基因组SSR标记提供了理论依据，为建立茶树EST-SSR标记和探索其在功能基因发掘、种质鉴定、遗传多样性分析中的应用???定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 EST序列的获得 　　1.2 EST-SSR的搜索与预处理 　　1.3 EST-SSR引物的设计与合成 　　1.4 基因组DNA提取与PCR扩增 　　试验中所用的19份茶树样品材料来自中国农业科学院茶叶研究所和湖北省农业科学院果树与茶叶研究所。采用天根生化科技（北京）有限公司植物基因组DNA提取试剂盒提取每个样品材料的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其基因组DNA质量，-20 ℃下保存备用。PCR反应体系为15 μL，包括2×PCR Master Mix 7.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各 0.6 μL，基因组DNA 1.0 μL，ddH2O补至15 μL。PCR 反应在Bio-Rad S-1000TM PCR仪上进行。反应程序为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，最适退火温度退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；最后 72 ℃延伸 10 min，结束后将产物置于4 ℃保存。PCR 扩增产物采用 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性，250 V 电泳 2.5 h，电泳结束后银染显色，并记录。 　　2 结果与分析 　　2.1 EST-SSR分布频率及特点 　　47 913条茶树 EST 序列经拼接处理后共获得26 185 条无冗余、高质量的 EST序列。运用Misa软件对26 185条共12 552 726 bp的非冗余EST序列进行SSR 搜索得到6 283条微卫星序列，占 EST总数的 23.99%。经过统计分析发现，1～6个碱基的排列组合重复均能被检出，但各种类型的EST-SSR 出现的频率数量大不相同，共有4 153个单核苷酸型SSR、2 935个二核苷酸型 SSR、977个三核苷酸型 SSR、76个四核苷酸型 SSR、41个五核苷酸型 SSR 及 62个六核苷酸型 SSR。 　　如图1 所示，从微卫星数目的角度分析，以单核苷酸重复的数目最多，占 50