猪圆环病毒2型cap蛋白B细胞线性抗原表位鉴定课件.pptxVIP

猪圆环病毒2型cap蛋白B细胞线性抗原表位鉴定汇报人： 导 师：摘要： 研究报道，Cap蛋白由233-235个氨基酸组成，其中包含多个线性和构象抗原表位，本研究基于目前的研究报道对Cap蛋白的抗原表位进行鉴定和分析。首先构建重组载体pET Cap，利用原核表达系统表达Cap蛋白。对己经表达的Cap蛋白与之前实验室己有的酵母Cap蛋白进行反应原性比较，酵母表达的Cap蛋白要好于原核表达的Cap蛋白。用酵母表达的Cap蛋白作为抗原对BALB/c雌鼠进行免疫制备单克隆抗体获得3株杂交瘤细胞株，命名为1E7, 4E2, 5D1，其中1E7和4E2可分泌抗Cap蛋白的单克隆抗体，5D1可分泌抗His标签的单克隆抗体。 其次，本研究对Cap蛋白进行截短表达，去除Cap蛋白的核定位信号后，设计引物构建载体表达19个短肽，命名为JD1--JD19。利用短肽扫描法，将短肽与单克隆抗体反应，初步鉴定出两个线性抗原表位;再利用该方法对已经鉴定的表位进行进一步的截短，最后确定两株单克隆抗体所识别的精确表位分别为77NDFLPPG83和’138YDPYVNY144。在已经定的表位当中77NDFLPPG83与之前文献报道的表位有部分重叠，而138YDPYVNY144之前文献并无报道,为最新发现的表位，补充了关于Cap蛋白抗原表位的分析。最后，由于单克隆抗体进行间接免疫荧光鉴定时与病毒反应强弱不同，利用生物学软件对已鉴定的抗原表位进行分析，绘制Cap蛋白和PCV2病毒粒子图谱，分析表位在图谱上的位置。 综上所述，本研究制备抗Cap蛋白的单克隆抗体，利用短肽扫描的方法鉴定出2个Cap蛋白的抗原表位，其中表位138YDPYVNY144为最新发现的表位，通过生物学软件对该表位在蛋白和病毒粒子上定位，从而进行分析，可知抗原表位在病毒粒子上的位置与其反应原性有关。技术路线：Cap蛋白的原核表达和抗原性比较PCV2 Cap蛋白基因的扩增与鉴定Cap蛋白原核表达及SDS分析PCV2 Cap蛋白原核表达载体的构建原核表达Cap蛋白纯化原核表达与真核表达Cap蛋白的反应原性比较转化与挑菌重组质粒的提取、鉴定和测序技术路线：PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定单克隆抗体分泌的稳定性检测动物免疫阳性杂交瘤细胞的培养间接ELISA方法的建立稀释Cap蛋白，ELISA板包被,加入HRP标记的山羊抗鼠IgG腹水的制备与纯化单克隆抗体特性鉴定上清与腹水效价的检测细胞融合单克隆抗体亚型的鉴定Western blot检测阳性杂交瘤细胞的筛选与培养PCV2 Cap蛋白抗原表位鉴定间接免疫荧光(IFA)检测技术路线: PCV2 Cap蛋白抗原表位鉴定Cap蛋白的截短表达截短蛋白的表达及SDS的分析Cap蛋白抗原表位的精确鉴定Cap蛋白抗原表位的鉴定Dot-blotting筛选和间接ELISA检测Cap蛋白抗原表位的初步鉴定, (1)间接ELISA方法检测 (2) Dot-blotting筛选Cap蛋白抗原表位空间位置分析(利用蛋白结构分析软件spdbv和DS2.5C)结果：Cap蛋白基因PCR扩增从PCV2病毒中提取DNA，并且以其为模板利用引物进行PCR扩增出Cap蛋白基因，电泳进行结果分析，所扩增出目的片段大小为722bp，与Cap蛋白基因大小相符，并且阴性对照没有条带，结果成立 对重组质粒pET Cap进行Not I和Sal I双酶切鉴定，双酶切后得到两条目的带，一条大小约为710bp左右，该条带为Cap蛋白基因目的条带;另一条带大小约为5400bp左右，该条带为线性pET 30a载体条带。重组质粒pET-Cap的酶切鉴定Cap蛋白的SDS分析分别取诱导前和诱导后的菌液处理，进行SD S分析，电泳结果显示经过160C诱导后在34kd的位置与诱导前比较有一条明显条带，该条带为目的带。将诱导后的菌液进行SDS分析，结果显示大部分的目的蛋白存在于上清之中，可知原核表达的Cap蛋白为可溶性蛋白。Cap蛋白诱导前后SDS分析将可溶性蛋白进行Ni+柱纯化，纯化得到的Cap蛋白进行SDS分析。Cap蛋白原核表达与真核表达的比较将纯化后的原核表达的Cap蛋白与真核表达的Cap蛋白进行western blot分析，分别选用感染猪圆环病毒的阳性猪血清和SPF猪的阴性血清作为一抗孵育，DAB显色结果，两种表达系统表达的Cap蛋白均可以与阳性血清发生反应。单克隆杭体亚型的鉴定单克隆抗体的Western blot鉴定分别将酵母表达的Cap蛋白以及带有His标签的PRV VPS蛋白进行SDS电泳分析，分别以杂交瘤细胞的上清作为一抗，山羊抗鼠HRP-IgG抗体作为二抗，DAB进行显色，结果显示杂交瘤细胞株1E7，4E2只与Cap蛋白反应，而5D1除Cap蛋白外还可以与His标签的VP5