基因诊断和基因治疗80.ppt

化学法： （1）磷酸钙沉淀法： 把目的DNA溶解在Hepes溶液中，然后缓慢加入 Na2HPO2·CaCl2溶液中，目的DNA可被包在磷酸钙溶液中，它可被细胞吞噬，目的基因便进入细胞内。 （2）DEAE-Dextran法（二乙胺乙基萄聚糖法） 将DNA溶解在TBS[含Tris K+ Na+ 等]缓冲液中 与DEAE-Dextran混合，滴加到受体细胞表面，目的 DNA便可进入细胞内。 （3）脂质体介导基因转移法 脂质体是由PL、Ch等形成的一种可以高效包装的人造单层膜。与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 2. 病毒载体基因转移法 利用病毒DNA作为载体，整合到宿主细胞的基因组内。 脂质体介导的基因转移示意图 目 录 （五）外源基因的表达筛选： 利用载体中的标记基因对转染细胞进行筛选，在表达载体中有neor (neomycin resistance)标记的抗药物G418基因存在。在加入药物G418的培养液中被转化细胞可存活，而未被转化的细胞不能存活。 （六）回输体内： 将带有治疗基因的细胞回输体内而发挥作用。 如：淋巴细胞可静脉回输入血，造血细胞可自身骨髓移植方法等。 五、 临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题： （1）患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交叉耐受，最终导致化疗失败。 （2）大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。 肿瘤的基因治疗研究 肿瘤基因治疗要达到以下三个目的：A 增加机体免疫功能，即杀伤肿瘤细胞 的能力B 抑制癌基因的表达，或导入正常的抑 癌基因逆转肿瘤细胞的恶性表型C 增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性 ?干扰性基因治疗：通过基因干预，抑制肿瘤细胞中过度表达的癌基因，从而降低其恶性表型。 ?自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞。 ?肿瘤的免疫基因治疗：激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。 ?提高化疗效果的辅助基因治疗： 药物增敏基因治疗； 耐药基因治疗。 肿瘤基因治疗的策略 1. 干扰性基因治疗 ? 反义核酸技术——把人工合成的DNA/RNA片段导入肿瘤细胞，它们可以与癌基因DNA/mRNA的特定部位结合，从而抑制癌基因的转录或翻译。这些DNA/RNA片段称为反义核酸。 ? 核酶—— 具有催化活性的RNA，设计特定的核酶，使之可以特异的识别和切割癌基因的mRNA或病毒RNA。 ? 抗核酸—— 是一些单链DNA片段，可与癌基因的某一部位特异结合形成三股DNA，从而封闭基因的表达。 ? RNA干扰（interference RNA, RNAi）： 21～23bp 的双链RNA，可以识别和结合癌基因mRNA 的特定部位，促进mRNA的降解，从而抑制癌基因的表达。 例如 癌基因bcl-2在 Burkit t淋巴瘤中过表达, 抑 制细胞凋亡和增加癌细胞的抗药性，向癌 细胞中导入bcl-2 mRNA的反义核酸，可抑制 bcl-2的表达，降低癌细胞的抗药性，和诱导细 胞凋亡。 2．补替缺陷基因（补偿性基因治疗） 向缺失某种抑癌基因的细胞导入正常的抑癌基因，可逆转其表型，抑制其增殖，诱导其凋亡。 ? 用腺病毒载体向小鼠前列腺癌导入治疗基因P53，2天后细胞开始凋亡，3周后前列腺癌消失。 3．向肿瘤细胞导入细胞因子或其受体基因（非特异性基因治疗） 增加机体的局部免疫功能 例如：IL-2 TNF-α GM-CSF INFα HLA-B7 HLA-B27等 从而： ①促进免疫效应细胞的分化增殖，增加对肿瘤细胞 的杀伤能力 ②直接杀伤肿瘤细胞如 TNF-α ③增加肿瘤细胞的免疫原性 ④调节其他细胞因子的分泌 药物增敏基因治疗： 为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。 4．向肿瘤细胞导入药物敏感基因（自杀基因） 例1： 丙氧鸟苷/胸嘧啶激酶（GCV/HSV-tk） HSV-tk（来自疱疹病毒） GCV——————————— G