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DBS 江苏省地方标准 DBS 32/ XXX—XXXX 食品安全地方标准 食品微生物学检验 生鲜乳中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物 检验方法-杯碟法 征求意见稿 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 江苏省卫生厅发布 前言 本标准为首次发布。 食品安全地方标准 食品微生物学检验生鲜乳中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法-杯碟法 范围 本标准规定了生鲜乳中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物的检验方法。 本标准适用于生鲜乳中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质的检验。舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质的检验 本方法的检出限为4U/mL。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 卫监督发〔2009〕44号 卫生部关于印发乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法-杯碟法的通知 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 抑菌圈测量仪或测量尺。 恒温培养箱：36±1℃。 高压灭菌器。 无菌培养皿:内径90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。 无菌牛津杯：外径(8.0±0.1) mm，内径(6.0±0.1) mm，高度(10.0±0.1) mm。 pH计。 无菌吸管：1mL（0.01mL刻度值），10mL（0.1mL刻度值）。 加样器:5μL～20μL，20μL～200μL及配套吸头。 培养基和试剂　 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级水。 试验菌种：藤黄微球菌(Micrococcus luteus) CMCC(B) 28001，传代次数不得超过14次。 磷酸盐缓冲溶液：按附录A中A.1规定。 青霉素标准溶液：按附录A中A.2规定。 β-内酰胺酶标准溶液：按附录A中A.3规定。 舒巴坦标准溶液按附录A中A.4规定。 营养琼脂培养基：按附录A中A.5规定。 抗生素检测用培养基：按附录A中A.6规定。 操作步骤 菌悬液的制备 将藤黄微球菌接种于营养琼脂上，经36±1培养18h～24h，磷酸盐缓冲液制成新鲜的菌悬液，终浓度应大于1×1010 CFU/mL，当天配制当天使用。 样品的制备 将待检样品充分混匀，取1 mL待检样品于1.5 mL离心管中共4管，分别标为：A、B、C、D，每个样品做三个平行，共12管同时。 检验用平板的制备 取90mm灭菌玻璃培养皿，底层加10 mL灭菌的抗生素检测用培养基,待其凝固。 另取适量抗生素检测用培养基～藤黄微球菌藤黄微球菌抗生素检测用培养基 图1 样品的测定 依次将β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液、青霉素标准溶液加入到： A 青霉素5 μL。 B 舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。 C β-内酰胺酶25 μL、青霉素5 μL。 D β-内酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。 混匀后，将上述A～D 试样各200 μL加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36±1培养18～2 h ，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。 结果报告 磷酸盐缓冲液结果应为：（A）、（B）、（D）均应产生抑菌圈；（A）的抑菌圈与（B）的抑菌圈相比，差异在3 mm以内(含3 mm)，且重复性良好；（C）的抑菌圈小于（D）的抑菌圈，差异在3 mm以上(含3 mm)，且重复性良好。如为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定。 如果样品结果中（B）和、（D）均产生抑菌圈，且（C）与（D）抑菌圈差异在3 mm以上（含3 mm）时，可按.1.1、.1.2 判定结果 （A）的抑菌圈小于（B）的抑菌圈差异在3 mm以上(含3 mm),且重复性良好，应判定该试样添加有β- 内酰胺酶，报告β- 内酰胺酶类药物检验结果阳性。 （A）的抑菌圈同（B）的抑菌圈差异小于3 mm，且重复性良好，应判定该试样未添加有β内酰胺酶，报告β内酰胺酶类药物检验结果阴性。 如果（A）和（B）均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再进行检测。 （规范性附录）培养基 磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4） 无水磷酸二氢钾 14.0g 无水磷酸氢二钾 5.2g 蒸馏 1000mL 121℃高压灭菌15min。 青霉素标准溶液 准确称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为0.1mg/mL的标准溶液。当天配制，当天使用。 β-内酰胺酶标准溶液 准确量取或称取适量β-内酰胺酶标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为适宜浓度的标准溶液。当天配制，当天使用。 舒巴坦标准溶液 准确称取适量舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为1mg/mL的标准溶液，分装后-