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基于连续扫描方式激光共焦扫描显微镜研制 　　摘要： 研发了一套基于连续扫描的激光共焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscopy，LCSM）系统。该系统采用工作台连续运动方式实现扫描，提出了利用单次采集的数据滤除随机噪声的方法，避免了多帧取平均对成像速度造成的影响。实现连续扫描的关键在于解决工作台运动与数据采集的同步问题，利用采集卡有限采集模式，合理匹配工作台参数和采集参数，成功解决了这一问题。详细介绍了影响分辨率的因素，通过合理选取探测器针孔直径，取样间隔，确保了实现高分辨率的要求。系统利用Visual C#开发的控制平台，成功地对生物细胞进行了扫描成像。实验结果表明：基于连续扫描的LCSM具有较高的分辨率，生成的显微图像没有任何畸变，并且成像速度有了大幅度提高。 　　关键词： 　　显微镜； 扫描； 采集； 同步； 随机噪声 　　中图分类号： O 436文献标识码?? Adoi： 10.3969/j.issn2013.05.014 　　引言 　　激光共焦扫描显微镜（LCSM）广泛应用在生物医学和材料科学等领域[1]，因其具有三维成像能力和良好的横向分辨率和纵向分辨率[24]受到了广泛的关注。传统的扫描共焦显微镜，一般采用光束扫描式[5]，利用两个相互垂直的平面扫描振镜实现光学切片二维扫描[6]；然而，对于超大视场的成像，光束扫描方式由于在扫描过程中使光束发生偏转，会在视场边缘产生球差，引起视场边缘成像与中心成像分辨率的不一致，从而容易导致光斑的空间轮廓形状凹凸不平[7]。近年来，提出了一种采用数字微镜器件的并行共焦检测系统[810]提高成像速度的方法，但是在微透镜阵列焦平面上得到的焦点是非均匀分布的，产生了一些畸变，与理想的焦点发生了位移。因此，采用工作台运动实现扫描，即激发光的会聚焦点静止而载物台进行二维或三维运动实现连续扫描。这种工作台运动扫描方式，优点是在对超大视场的逐点扫描成像时，可以在整个视场区域实现一致的高分辨率成像，缺点则是成像速度慢。 　　为了提高成像速度，本文对工作台运动扫描方式LCSM中传统的多帧取平均的方法进行了改进，设计并实现了一种基于工作台连续运动的LCSM系统，并且提出了单帧成像滤除随机噪声的方法。 　　1反射式LCSM的工作原理 　　图1是设计的反射式LCSM系统原理图，该系统主要由几大模块组成，包括：光学成像模块、光电转换及放大模块、机械扫描模块、数据采集及数据处理模块。 　　其中光学成像模块采用无限远光学系统，由于其系统中存在一段平行光路，在光学结构设计和像差矫正上具有一定的优势。入射光波为405 nm的激光，该波长不仅不会杀伤细胞，而且满足高分辨率的要求。采用共轭技术成像，使光源、被测样品及探测器处于彼此对应的共轭位置上。入射激光经过分光镜反射后聚焦到样品的某点处，由该点激发出来的荧光透过显微物镜，光束经过分光镜与高通滤波器后，仅有荧光波段通过，荧光通过成像透镜聚焦于针孔处，非焦平面上的杂散光被滤掉，通过针孔的荧光被光电倍增管接收，工作台通过作三维扫描便可以完成对光学断层成像。 　　2影响LCSM分辨率的因素 　　2.1针孔大小及取样间隔的选择 　　针孔的大小与爱里斑的直径相关，许多人对LCSM的三维光学传递函数与探测器前方针孔直径之间的关系进行了研究[1112]。结果表明[11]，该针孔直径不必非常小。当针孔直径恰好等于一个爱里斑所成像的大小时，探测器接收到的光能量较高，既可以提高信噪比，又不会对分辨率造成特别大的影响。爱里斑经过无限远光学系统放大后，其像的大小为： 　　其中，β为系统的放大倍率，λ为入射光波长，NA为数值孔径。已知β=40倍，λ=405 nm，NA=0.95，根据式（1）计算得到爱里斑像的大小约为20 μm。因此，该系统选用20 μm针孔直径。取样间隔遵循的原理是奈奎斯特采样定理，将爱里斑作为周期信号，能够区分两个爱里斑的取样间隔为0.25个爱里斑直径，将取样间隔定位在100～125 nm之间，即可满足还原高分辨率图像的要求。 　　2.2数据分配消除随机噪声 　　随机噪声具有很宽的频谱，若采用低通滤波，必然会造成图像的高频成分损失。传统的做法是多帧平均，根据随机噪声互不相关的特点，且均值为零，可以有效的压缩噪声。具体的方法就是在被测实验样本荧光极弱的情况下可通过多帧平均的方法来提高信噪比。尽管纳米位移台的重复精度很高（小于5 nm），但是多帧平均会使扫描时间成倍增加，为了在一次扫描时间内完成滤除随机噪声的任务，提出了利用数据分配滤除随机噪声的方法，即在每一点附近采集多次，再将这些值累加或加权取平均得到该点的能量值。具体原理如下所述。 　　在任意时刻采集的数据为： 　　累加后的信