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体外共培养环境对犬脂肪干细胞、口腔上皮细胞影响 　　【摘要】 目的：探讨体外共培养环境对犬脂肪干细胞（ADSC）、口腔上皮细胞（OK）移行速率、增殖速率的影响。方法：获取犬ADSC和OK并鉴定，将两种细胞种植于同一个刻度培养皿内，检测共培养环境下细胞的移行速率，与单一细胞培养环境作对比，观察细胞移行速率的改变。收集两种细胞培养上清，加入到对方培养基中，形成体外模拟混合培养环境，MTT法检测细胞增殖曲线的改变。结果：共培养环境下，OK、ADSC细胞的移行速率均较单一细胞培养环境下高。与常规培养相比，在体外模拟共培养环境下，OK、ADSC细胞的增殖曲线均变陡。结论：在体外共培养环境中，ADSC、OK呈现互相促进、互相吸引、协同增殖态势，细胞的移行速率、增殖速率均得到提高，能够共同用于组织工程口腔黏膜的构建。 　　【关键词】 脂肪干细胞； 口腔上皮细胞； 组织工程； 共培养 　　中图分类号 R329.2 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2013）36-0001-03 　　各种原因造成的尿道狭窄、尿道缺损是一个难题，近年来，口腔黏膜被认为是用于尿道重建的较为理想的替代物。但口腔黏膜的获取，也会给患者带来诸如感觉麻木、开口及活动受限等合并症。组织工程技术的发展为这一难题的解决带来了新的希望[1]。组织工程口腔黏膜有望成为尿道重建领域一个理想的修复重建材料[2]。脂肪干细胞（adipose tissue derived stem cell，ADSC）是2001年Zuk等[3]从人脂肪组织中分离培养出的一种多能干细胞，它能够经由旁分泌方式，分泌多种生长因子，这些生长因子能够激活上皮细胞，促进上皮缺损的修复[4]。将ADSC引入组织工程口腔黏膜研究，将具备良好的应用前景。本实验研究体外共培养环境对犬口腔上皮细胞（oral keratinocytes，OK）和ADSC增殖速率、移行速率的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 ADSC的获取和鉴定 　　取Beagle犬腹部皮下脂肪组织，经Ⅰ型胶原酶（Worthington，美国）消化获得ADSC，以含10% FBS的DMEM培养液（Gibico，美国）培养，每3天换液一次，细胞融合达90%时，以0.25%胰蛋白酶（Gibico，美国）消化传代。取P3 ADSC，行流失细胞检测，检测细胞表面CD34、CD44、CD45、CD90、CD105和CD106的表达。 ??　1.2 OK的获取和鉴定 　　取Beagle犬颊黏膜，经2.0 U/ml的Dispase Ⅱ（Roche Corporation， Germany）消化、0.05%胰蛋白酶（Gibico，美国）消化后，获得OK，以KSFM培养基培养，细胞融合达到90%时，以0.05%胰蛋白酶消化传代。取P1 OK，爬片，行免疫荧光检测细胞AE1/AE3的表达。 　　1.3 细胞移行速率的检测 　　将P3 ADSC和P1 OK种植到同一个刻度培养皿的两端，每日定时检测记录细胞的移行速率，作为对照，刻度培养皿两端均种植ADSC或OK，记录细胞移行速率。 　　1.4 细胞增殖速率的检测 　　在ADSC细胞达到50%融合时，每日收集培养液上清，经过滤除菌后，与KSFM培养基1∶1比例混合，形成ADSC条件培养基（ADSC-CM），培养OK细胞，MTT法检测细胞的增殖速率。在OK细胞达到50%融合时，每日收集培养液上清，经过滤除菌后，与KSFM培养基1∶1比例混合，形成OK条件培养基（OK-CM），培养ADSC细胞，MTT法检测细胞的增殖速率。同样检测正常培养条件下OK、ADSC的增殖速率。 　　2 结果 　　2.1 成功获取ADSC和OK 　　经酶消化法能够顺利获得ADSC和OK，ADSC呈纺锤形，少数有突起，为不规则状（图1左），细胞相互之间以细丝拉网。流式细胞检测表明CD90、CD34、CD44、CD105表达呈阳性，CD106、CD45表达呈阴性。OK细胞呈多角形，融合后的细胞呈现典型的“铺路石”样外观（图1中），细胞形态均一、稳定。免疫荧光见细胞AE1/AE3表达阳性（图1右）。 　　2.2 共培养环境下细胞移行速率升高 　　在单一培养环境下，ADSC移行速率为0.8～5.5 mm/d，共培养环境下ADSC的移行速率增高为0.8～6.8 mm/d。单一培养环境下，OK移行速率为0～1.5 mm/d，共培养环境下OK的移行速率增高为0.2～2.5 mm/d（图2）。 　　2.3 共培养环境下细胞增殖速率升高 　　MTT检测表明，与常规培养相比，ADSC-CM培养环境下OK细胞的增殖曲线明显变陡。同样，OK-CM培养环境下ADSC细胞的增殖曲线也呈变陡趋势（图3）。 　　3 讨论 　　尽管报道的