白藜芦醇对椎间盘髓核细胞产生IL―6和IL―8影响.docVIP

白藜芦醇对椎间盘髓核细胞产生IL―6和IL―8影响 　　[摘要] 目的 探讨白藜芦醇对IL-1β诱导椎间盘髓核细胞产生IL-6和IL-8的影响。方法 原代培养椎间盘髓核细胞，并用5ng/mL IL-1β预孵育2 h。随后加入不同浓度的白藜芦醇孵育12～48 h。ELISA检测培养上清中IL-6和IL-8的产生。结果髓核细胞未经任何处理情况下，产生的IL-6和IL-8较低。IL-1β作用2 h后，IL-6和IL-8产生显著增多。而细胞随后用5 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L白藜芦醇处理后，IL-6和IL-8含量随着白藜芦醇浓度的递增而逐渐降低。5 ng/mL IL-1β作用12 h即可诱导较高水平的IL-6和IL-8表达。其峰值位于24 h。而采用50 μmol/L 白藜芦醇作用后，IL-8和IL-8水平明显低于IL-1β组。结论 白藜芦醇能抑制IL-1β诱导椎间盘髓核IL-6和IL-8的产生，从而可能发挥阻断炎性因子对颈椎体的破坏作用。 　　[关键词] 白藜芦醇；椎间盘突出；盘髓核细胞；细胞因子 　　[中图分类号] R9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（c）-0057-02 　　腰椎间盘突出是一种慢性退行性疾病，其确切病因和病理生理机制仍不清楚[1]。目前，炎症因素在椎间盘退变中的作用日益受到关注[2]。参与椎间盘突出的炎症介质有很多，包括IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE2等[3]。IL-1β可以促使内皮细胞产生多种生物活性物质，还可以激活脑内的多种酶，如COX-2、iNOS等[4]。因此，以IL-1β作为炎症反应的诱导物，可广泛应用于各种细胞模型当中。该实验旨在探讨白藜芦醇对IL-1β诱导椎间盘细胞分泌细胞因子的影响，为研究椎间盘退行性病变的防治提供理论依据。现报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 主要实验试剂 　　白藜芦醇购自Sigma-Adrich公司（纯度99%）。用DMSO配制成 0.2 mol/L 母液备用，使用前DMSO终浓度不高 0.1 %。IL-6和IL-8购自深圳欣博盛生物科技有限公司。IL-1β购自Sigma-Adrich。细胞培养板购自Corning。 　　1.2 髓核细胞的原代培养 　　将椎间盘手术患者术体内获取的椎间盘组织用D-Hanks液清洗，并将髓核组织与纤维环及纤维环交界区组织剪成1 mm3的小块， 反复洗涤后加入0.25%的胰蛋白酶消化15 min。离心洗涤后继续用0.2% II型胶原酶消化4 h。用完全培养基终止消化并用200目尼龙网过滤后，吹打成细胞悬液后接种于6孔板中，37℃、5% CO2条件下培养。 　　1.3 实验分组与处理 　　待髓核细胞生长至融合度为90%左右时，根据不同的实验目的分为组：①空白对照组：仅加入0.1% DMSO；②IL-1β组（阳性对照组）：加入5 ng/mL IL-1β作用2 h；③Res组：加入终浓度为5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L 3种浓度，按不同的实验目的分别作用 0 h、12 h、24 h、36或48 h。培养中止后收集细胞，进行测定。 　　1.4 ELISA检测IL-8和IL-6的产生 　　收集感染后24孔板中细胞上清液，按照ELASA 试剂盒说明书检测IL-8、IL-6的水平。即，100 μL细胞上清液加入到每个捕获抗体包被的微孔板中，室温孵育2 h。洗板后，加入100 μL检测抗体，室温继续孵育2 h。随后弃混合物，每孔加入100 μL streptavidin-HRP，室温避光孵育20 min。最后，每孔加入100 μL底物，室温避光孵育20 min，然后加入50 μL终止液，分光光度计检测450 nm处OD值。 　　1.5 统计方法 　　采用SPSS 15.0统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用one-way方差分析并行Student’s t检验。 　　2 结果 　　2.1 髓核细胞的分离与培养 　　人椎间盘髓核组织培养后4 h，细胞尚未完全贴壁，形态学表现为圆形，胞浆比例较大，细胞核清亮。继续培养5～7 d后，髓核细胞开始贴壁并转化为梭形原代细胞且呈单层生长。随后细胞间开始有突起相连接。15～20 d后融合成片。 　　2.2 不同浓度白藜芦醇对IL-1β诱导髓核细胞产生IL-6和IL-8的影响 　　髓核细胞未经任何处理情况下，产生的IL-6和IL-8较低。IL-1β作用2 h后，IL-6和IL-8产生显著增多。而细胞随后用5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L白藜芦醇处理后，IL-6和IL-8含量随着白藜芦醇浓度的递增而逐渐降低。见图1。 　　2