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乌骨藤多糖脱蛋白工艺研究 　　[摘要] 目的 优选乌骨藤多糖脱蛋白工艺。方法 以蛋白脱除率和多糖保留率为评价指标，考察酶-Sevage法对乌骨藤多糖脱蛋白的效果。结果 酶-Sevage法的蛋白脱除率分别为75.09%，多糖保留率分别为89.83%。结论 酶-Sevage法脱蛋白的方法可行。 　　[关键词] 乌骨藤；多糖；脱蛋白 　　[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）23-55-03 　　乌骨藤为萝?科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤茎，主产于云南、贵州，始载于《滇南本草》[1]。乌骨藤味苦，性微寒，具有清热解毒、止咳平喘、抗癌等功效，用于咽喉肿痛、肺热咳喘和疮痈癌肿，以乌骨藤制成的片剂和注射剂广泛用于治疗肝癌、胃癌、直肠癌等恶性肿瘤[2]，其抗肿瘤效果显著。前期实验证实，乌骨藤多糖具有抗肿瘤活性[3]，但有关其多糖的研究报道较少。为了对乌骨藤多糖的结构、空间螺旋构型及抗肿瘤活性进一步研究，本文对水提醇沉法制得多糖中含有的蛋白进行了分离，对其脱蛋白工艺进行了研究，选用酶-Sevage法脱蛋白，兼顾考虑蛋白脱除率和多糖保留率，优化乌骨藤粗多糖脱蛋白方法，有关乌骨藤多糖脱蛋白的研究尚未见文献报道。 　　1 材料 　　乌骨藤购于安国杏林药材公司，经本校药学院中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为萝?科植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的藤茎，保存于辽宁中医药大学标本馆中。 　　紫外分光光度计（UV-1800型）；离心机（TDL-5-A）； 　　电子天平（上海天平仪器厂）；pH计；牛血清白蛋白（北京奥博星生物技术责任有限公司130225）；考马斯亮蓝G-250（国药集团化学试剂有限公司）；木瓜蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司，6×106U/g）；葡萄糖；重精馏苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、正丁醇均为分析纯。 　　2 方法 　　2.1 乌骨藤多糖的提取[4] 　　取乌骨藤药材250g，加6倍量95%乙醇回流提取2次，每次1h，过滤，药渣挥干乙醇后加8倍量水100℃提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至适当体积，加入95%乙醇使乙醇体积分数达到80%，静置过夜，抽滤，沉淀用有机溶剂洗涤，干燥得乌骨藤粗多糖。 　　2.2 乌骨藤多???的含量测定[5] 　　2.2.1 葡萄糖标准溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10.12mg，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得到葡萄糖标准溶液。 　　2.2.2 标准曲线的制备 精密量取葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL置于10mL具塞试管中，加蒸馏水补足至2mL，分别加入5%苯酚液1.0mL，充分摇匀，再加入浓硫酸5.0mL，摇匀，置于40℃水浴中反应15min，冷却至室温，490nm处测吸光度（A），另取蒸馏水2mL按上述显色方法作为空白，以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖浓度（C）为横坐标，得回归方程：A=0.0608C-0.1281，r=0.9996。 　　2.2.3 样品中多糖的含量测定 精密吸取样品溶液2.0mL，按“2.2.2”项下显色方法进行操作，分别测定吸光度，计算样品中多糖含量和多糖保留率，多糖保留率=脱蛋白后的多糖含量/脱蛋白前的多糖含量×100%。 　　2.3 乌骨藤多糖中蛋白质的含量测定[6] 　　2.3.1 蛋白质标准溶液的制备 精密称取牛血清蛋白10.04mg，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得到蛋白质标准溶液。 　　2.3.2 标准曲线的制备 精密吸取蛋白标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL的具塞试管中，分别加入考马斯亮蓝染液5mL，加蒸馏水补足至6mL，摇匀，放置30min，另取蒸馏水1mL按上述方法做空白，595nm处测定吸光度（A），以吸光度（A）为纵坐标，牛血清蛋白浓度（C）为横坐标，得回归方程：A=0.0347C+0.02，r=0.9992。 　　2.3.3 样品中蛋白质的含量测定 精密吸取样品溶液1.0mL，按“2.3.2”项下显色方法进行操作，分别测定吸光度，计算样品中蛋白质的含量和蛋白质脱除率，蛋白脱除率=（脱蛋白前蛋白质含量- 脱蛋白后蛋白质含量）/脱蛋白前蛋白质含量×100%。 　　2.4 酶-Sevage法脱蛋白方法考察[7] 　　精确配制0.02g/mL的乌骨藤多糖溶液100mL，加入木瓜蛋白酶2g，摇匀，调节多糖溶液的pH值使pH=7，恒温水浴40℃酶解1h，酶解结束后沸水浴10min灭活木瓜蛋白酶，离心除去变性蛋白沉淀，取上清