葡萄果醋发酵用醋酸菌分离与鉴定研究.docVIP

葡萄果醋发酵用醋酸菌分离与鉴定研究 　　[摘要]主要采用土壤以及烂化的葡萄皮作为样品，并进行利用增值培养以及定量、定性等培养手段，同时通过首次鉴定及再次鉴定等，从而筛选出一株具有较高醋酸、产量稳定的醋酸菌。 　　[关键词]葡萄果醋 醋酸菌 分离 鉴定 　　1前言 　　所谓的葡萄果醋，就是利用葡萄酒或者是葡萄进行产生的残渣皮，同时经过采用现代化生物技术进行酿制，进而形成的一种酸味饮料，该饮料含有独特的风味以及丰富的营养。葡萄果醋同时具备水果与食醋的营养保健作用，以及丰富的维生素和有机酸。能够有效调节血脂，抗氧化等功能。 　　2材料准备 　　首先准备的材料是醋醅，其属于一种无核紫葡萄。其次是菌种，其选择的是活性干酵母D254。再次是试剂的准备，有酚酞指示剂、酵母膏、葡萄糖、NaOH及无水乙醇等。最后就是培养基的准备，有醋酸菌固定培养基及醋酸菌保藏培养基，其中需要的琼脂、酵母膏、葡萄糖、碳酸钙及无水乙醇，分别是2%、1%、1%、2%、6%vol；1.8%、1%、1%、0.5%，6%vol，两中培养基均需自然pH值。而醋酸菌液体培养基需要1%的葡萄糖及酵母膏，6%vol的无水乙醇，也是自然pH值。 　　3葡萄果醋发酵用醋酸菌的分离研究 　　3.1增殖培养 　　针对醋酸菌的分离研究，首先采用容量为20mL的葡萄醋，该葡萄醋属于自然发酵的，接着放入容量为250ml的三角瓶当中，同时再添加容量为100ml的基础培养基，之后将其处于32℃恒温环境中进行培养，培养时间为两天。通过两天培养之后，进行提取容量为1ml的增殖液，并放入无菌蒸馏水当中，该蒸馏水的容量为9ml，然后进行稀释至三个梯度，分别是10-5、10-6及10-7，在这三个梯度里提取稀释液，每一个梯度均提取0.2ml。通过采用平板划线的方法与倾注的方法进行接种，并放置于分离培养基当中，给予每个梯度的平板分别三个，放在32℃的环境中进行培养，培养时间最长不能超过3天，最短不能低于2天，最后认真观察。在平板中的稀释液有着不一致的稀释度，所以在进行挑选单菌落时，必须从该平板中进行挑选，才能挑选出形态相同、长势较好以及菌落完整的单菌落。经过单菌落纯化后的菌株，在斜面保藏培养基进??接种，然后通过在32℃的环境下进行两天培养之后，保藏在4℃的冰箱里。 　　3.2醋酸菌定性培养 　　选取一环活化的菌株，分别在容量为100ml的基础培养基里进行培养，此基础培养基中含有3.0%vol乙醇，并放在32℃恒温环境当中进行静置培养，培养时间为三天。然后通过采用离心机将菌体清除，在一个小烧杯里放入容量为5ml的无菌体培养液，再利用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液进行中和，直到其培养液显示为中性为止。最后滴入5.0%的FeCl3溶液，滴入的滴数为5滴，观察其变化情况，如果有红褐色的沉淀出现，那么该菌株很大程度上就是醋酸菌。把醋酸菌菌株放在斜面培养基里进行接种，经过在32℃环境中进行培养2天之后，保存于4℃的冰箱中。 　　3.3醋酸菌定量培养 　　选出良好的醋酸菌之后，分别放入醋酸菌液体培养基里进行接种，并在30℃的环境下进行3天的培养，然后进行测定培养后的醋酸菌的产酸量，通过采用碱式滴定的方法进行测定，其公式为V 　　V0×CNaOH×60 　　L，在这个公式当中，V0表示的是在选取空白培养基作为对照滴定所用氢氧化钠的体积数，CNaOH表示的是氢氧化钠的浓度，60指的是醋酸的分子量，L表示的是样品的体积。表示样品进行发酵过程中所利用的氢氧化钠的体积数。最后将产酸量比较高的菌株进行筛选出来，同时再进行第二次筛选。 　　4葡萄果醋发酵用醋酸菌鉴定分析 　　4.1首次鉴定 　　首先仔细观察菌株接种的形态变化。在平板培养基里进行接种的菌株，通过在32℃恒温环境中进行培养两天之后，利用革兰氏染色法将获得的单菌落进行染色，并经过镜检，认真观察其染色的反应变化和形态的基本大小特点。其次进行生理生化实验。进行实验乙醇的过氧化和氧化。最后就是鉴定的一般措施。将待测菌株点种于鉴定培养基的平板当中，每六个菌株点种在一个平板上，培养环境中最低温度是30℃，最高温度是32℃，培养3～15天后，观察菌体在3天、6天、12天及15天的时间段中的变化情况。若在菌落附近没有透明圈产生，则未能将乙醇氧化，从而未能获取乙酸的菌株。菌落附近有透明圈出现，则表明该菌株能氧化乙醇成乙酸。二醋酸菌的属能需要加深氧化醋酸，让醋酸钙向碳酸钙进行转化，通过培养一定的时间之后，如果在菌落附近出现未透明的乳白色及伴有彩色光泽，这说明在液体基础培养基里存在乙醇氧化。此外，需要注意观察其是否产生无菌膜。 　　4.2再次鉴定 　　菌株通过产酸性试验及革兰氏染色之后，并进行生理化试验。其结果是由于在革兰氏染色的过程中，若没有控