“小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验”方法改进与研究.docVIP

“小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验”方法改进与研究 　　摘 要：连续3d给小鼠腹腔注射淀粉液，诱导并激活巨噬细胞，使用鱼红细胞为吞噬物，替代细胞实验教材所用的鸡红细胞、羊红细胞，探索和改进实验方法，以便更清晰、有效地观察小鼠腹腔巨噬细胞对外来异物的吞噬作用。取鼠腹腔液制备涂片并固定，用Giemsa染色法进行染色，显微观察巨噬细胞对鱼红细胞的吞噬作用。结果显示，采用鱼红细胞作为吞噬物，细胞染色清晰，吞噬结果明显，可清晰显示大量吞噬鱼红细胞的巨噬细胞，吞噬百分率高，便于实验观察和计数，有助于学生对巨噬细胞吞噬作用的理解和掌握。 　　关键词：巨噬细胞；鱼红细胞；实验方法；吞噬 　　中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）23-17-02 　　高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干细胞分化而来，是机体非特异性免疫功能的重要组成部分。当病原微生物或其他异物侵入机体时，由于巨噬细胞具有趋化性，便向异物处聚集，巨噬细胞可将之内吞入胞质，形成吞噬泡，然后在胞内与溶酶体融合，将异物消化分解，这在机体非特异性免疫中具有重要意义。静息的巨噬细胞吞噬功能低下，只有活化状态下的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力。现在所用细胞实验教材[1-4]所编列吞噬实验大多用鸡红细胞、羊红细胞、墨水、杆菌[5]、荧光微球等作为吞噬物，本文首次使用鱼血细胞作为吞噬物，对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬效果进行了探索和研究，以期避免使用家禽作为实验材料，并进一步完善了实验方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 鱼血红细胞稀释液的制备 从市场上购买鲫鱼，用注射器尾静脉采血，或解剖后从鱼血窦或心脏抽取鱼血。抽取的鱼血，不添加抗凝剂，直接用无血清L15培养基（Gibco，invitrogen Corporation），稀释10倍。配成10%鱼血红细胞悬液备用。 　　1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制备 称取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理盐水中，混匀后121℃高压灭菌20min备用。 　　1.2 方法 　　1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导 在实验前3d，连续3d定时给小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持针以45°斜角刺入，注意勿伤及内脏或注入肠内，注射后揉动腹部，分散淀粉粒，并观察注射后动物状态，以免小鼠死亡。 　　1.2.2 鱼红细胞的注射及腹腔液的收集 实验时，小鼠腹腔注射10%鱼红细胞悬液1mL，轻按小鼠腹部，使悬液分散。60min后，用颈椎脱臼法处死小鼠。将小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齿尖镊夹起皮肤层，用剪刀剪一环口，撕开腹部皮肤，充分暴露腹膜。此时，向腹腔注射1mL生理盐水，并轻揉腹部片刻。随后用剪刀剪开腹膜成一纵形口，用镊子将两边皮肤夹起来，以防腹腔液流出。把内脏推向一侧后，可用不装针头的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔内血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血细胞。 　　1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于洁净的载玻片上，按血涂片制备法制备细胞涂片。空气干燥后，载片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的载片，采用扣染法，即用牙签架起载片，细胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸缓冲液9份）染色载片，染色时间为20min。染色完成后，揭起载片，用滴管吸取蒸馏水轻缓冲洗载片，洗去多余的染液。 　　1.2.4 显微观察及吞噬百分率和吞噬指数的计算 载片空气干燥后，在OLympus BX41显微镜下观察，用DP70摄像头进行显微拍摄，并用IPP5.0软件进行显微照片标尺标记。40倍物镜下已能观察到游离的鱼红细胞及吞噬鱼红细胞的巨噬细胞。实验共用小鼠5只，实验过程中未出现死亡，每只小鼠制备5片涂片。每片随机观察数个视野，记录100个吞噬细胞的吞噬结果，计算吞噬百分率、吞噬指数。吞噬百分率（%）=吞噬鱼红细胞的巨噬细胞数/计数的总巨噬细胞数（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指数=巨噬细胞中所吞噬的鱼红细胞数/计数的总巨噬细胞数。 　　2 实验结果 　　2.1 巨噬细胞吞噬状态 在普通光学显微镜下，可清晰观察到主要的三类细胞，鱼红细胞、未吞噬鱼红细胞的巨噬细胞（图1中1）及吞噬一个或数个鱼红细胞的巨噬细胞（图1中2～4）。鲫鱼红细胞多为长椭圆形，核常位于细胞中部，胞核染为深紫色。巨噬细胞大多呈不规则形状，胞体表面不光滑，常有突触，细胞核较大，呈肾形、圆形或其他不规则形状，染为紫红色。巨噬细胞吞噬鱼红细胞，常能观察到以下几种吞噬状态：巨噬细胞内鱼红细胞膜仍完整；巨噬细胞内鱼红细胞膜不完整或破裂；巨噬细胞内具有一个或数个大小不等的鱼红细胞细胞核；还可观察到巨噬细胞膜凹陷，鱼红细胞紧贴在凹陷处正在被