第五章外源基因在原核和真核细胞中的表达A.ppt

第五章 外源基因在原核细胞中的表达 表达目的 (1)产生大量标记cRNA作为探针； (2)产生突变型和野生型蛋白，供研究蛋白质结构与功能之用。 (3)生产商业性蛋白，如药物； (4)制备抗体； (5)捕捉相互作用的分子。 基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。 原核表达系统是了解得最为深入，应用最为广范的表达系统。 第一节 原核基因表达的特点 在大肠杆菌是主要的克隆宿主，通过基本克隆载体上加上合适的转录和翻译调控序列即可使它变为表达载体。 大肠杆菌表达载体带有强启动子经常是可诱导的，如lac或trp操纵子，启动子或T7后期启动子(T7 RNA聚合酶基因从可诱导的启动子表达)。 表达载体还包含了转录终止子和核糖体结合位点、S-D序列。这些元件的排列通过优化产生稳定的RNA和大量的蛋白。 一.表达特点: (1)只有一种RNA聚合酶； (2)表达以操纵子为单位； (3)转录与翻译偶联； (4)原核基因一般不含内含子； (5)原核基因调控主要在转录水平； (6)原核mRNA的起始密码子前要有S－D序 列。 二.外源基因在原核细胞中表达必须考虑两个关键问题： (1)增加基因的拷贝数； (2)促进克隆基因的正确表达。 与此有关的因素： ①表达载体 ②外源基因的性质 ③启动子和S－D序列 ④阅读框架的衔接 ⑤宿主的调控系统 具体如下； 三.外源基因表达应注意的具体事项： (1)选择合适的多拷贝载体将外源基因导入宿主细胞中表达； (2)外源基因不能有内含子； (3)必须利用原核的强启动子和S－D序列，S－D序列和起始密码子的距离要恰当； (4)外源基因与表达载体连接时，要能形成正确的开放读框。 (5)要利用调控系统使产物尽可能高效表达，并防止外源基因产物对宿主菌的毒害。 第二节 克隆基因的表达 表达策略： 共同问题是高效表达，此涉及增加载体的拷贝数和促进克隆基因的正确表达。 表达大量蛋白的细胞比野生型细胞生长缓慢，因此产生表达载体丢失或表达水平下降的选择突变。可诱导启动子的使用有助于避免这一问题。 构建分泌载体(secretion vector)。可以将过度表达的蛋白从细胞中移去而增加稳定性；如表达的蛋白有毒性，分泌对细胞的存活有利；分泌有利于蛋白纯化。 一.增加基因的拷贝数 1.以?噬菌体为载体 ?噬菌体感染E.coli后，可产生100个以上的子代噬菌体，即使外源DNA增加到100以上的拷贝。用此法使连接酶的产量增加500倍。 2.采用多拷贝质粒 松弛型质粒在细胞中有15～20个拷贝。经氯霉素处理可增至成千个拷贝。 3.采用删除rop基因(在复制起点附近)的质粒。 如pUC质粒。 4.构建失控质粒(runaway plasmid)(逃跑质粒，脱缰质粒 ，复制控制失控的质粒载体) 因高拷贝质粒可产生超量的蛋白产物，常导致宿主细胞死亡。用低拷贝质粒产量又低，为了解决此矛盾构建了失控质粒。 如pBEU1/2质粒在30℃时为低拷贝,在35℃以上2～3小时后，拷贝数可增加100倍，此时细胞生长受到抑制，而质粒DNA可达细胞总DNA的50％。 这些质粒都带有抗性标记和多个酶单一识别位点。 二.构建增加转录的载体 1.克隆基因表达的条件： (1)克隆基因必须和载体的调控元件正确连接； (2)克隆基因必须在启动子的控制下，而启动子必须能被宿主的RNA pol所识别。 (3)mRNA必须稳定，并能有效被翻译。 (4)产生的蛋白不会被宿主的酶所降解。 2.外源基因在原核细胞中表达的调节元件 (1)常采用的启动子 ①Lac启动子： UV5突变的Lac启动子对分解代谢抑制不敏感，即使在无CAP-cAMP时也照常转录。 用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导可使产量增加50倍。 构建含有两个连续的Lac启动子载体，使阻遏蛋白阻遏不完全，从而提高表达水平。 ②trp启动子 用?-吲哚丙烯酸(IA)或吲哚-3-乙酸(IAA) 诱导，IA或IAA能与阻遏蛋白原结合，因此它是色氨酸的竞争抑制剂。这样阻遏蛋白就不能和色氨酸结合，它就不会被激活，也就不能和操纵基因结合。有报道用此法可使产物增加50倍。 用缺失衰减子的trp操纵子，因缺失衰减子使它对体内存在的色氨酸不敏感。此法可增进转录8～10倍。 构建含有2～3个连续的trp启动子，可提高转录4～5倍。 ③PL和PR启动子 PL和PR是?噬菌体的两个强启动子，比Lac启动子的活性高8～10倍，比Trp启动子高11倍。。它可被CI蛋白所阻遏。所以是强而可调节的启动子。因外源蛋白大量产生时可阻断宿主细胞的生长，且在某些情况下质粒DNA转录水平过高能干扰质粒的复制，导致质粒的丢失。 用CI基因温度敏感突变型(42℃时CI被破坏,