第三章 蛋白质修饰表达.ppt

 蛋白质的化学修饰：通过活性基团的引入或去除使蛋白质化学(一级)结构发生改变的过程。 非必需部分的修饰：不影响蛋白质的生物活性。 必需部分的修饰：影响蛋白质的生物活性 。 其它侧链基团的修饰 二硫键的化学修饰 组氨酸残基的咪唑基修饰 酪氨酸残基的酚羟基修饰 精氨酸残基强碱性的胍基修饰 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 1．重氮化法 2．戊二醛法 3．过碘酸盐氧化法 4．混合酸酐法 5. 碳二亚胺（EDC）法 蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白质。 五、基于蛋白质片段的嵌合修饰 主要方法　　　　　　 非共价键相互作用 二硫键　 常规肽键（化学法、酶法）　　　　　　　 非肽共价键 1.非共价键缔合系统 　　 稳定蛋白质三维结构的各种作用力 /structure/proteinstructure11.asp 蛋白质的三维结构依赖于非共价相互作用。 蛋白质的三维结构 /lab_cn/_resources/images/pics/02/Charpter_02.htm ( 二聚体蛋白质的三维结构) 方法：　 破坏这种非共价相互作用，则两条肽链分开;　再混合在一起，则可形成原来的构型，活力也随之恢复。 ２.二硫键与嵌合蛋白的形成 　　 彼此分开的多肽链片段可用二硫键相连接。 方法： 还原剂（如DTT、二硫苏糖）打开二硫键，分开两条多肽链；其中一个片段与适当被修饰的或合成的另一多肽段相混合，形成新的嵌合分子。 应用： a.了解胰岛素的结构功能。 图为 某种胰岛素的结构 /zhuyei/shengwu/index0-2.htm (蛋白质结构) b.了解抗体的功能与结构。 图为抗体结构 /d/d/biochemistry/chat3/sh3-5_1.html (远程教育生物化学--第三章蛋白质) 3.通过酶连接反应形成肽键 从猪胰岛素生产人胰岛素 优点： 　　猪胰岛素来源丰富，将猪胰岛素改造成人胰岛素，在临床上有着极其重要的意义。 胰岛素的产生过程 反应式： Lys-Ala + Thr-(But)-OBut Lys-Thr-(But)-OBut + Ala Thr-(But)-Obut是苏氨酸的侧链-OH和 α－COOH，用叔丁基保护。 化学修饰是一种重要的设计蛋白质的手段。迄今为止，已有一百多种蛋白质被修饰后在临床应用等许多领域显示出优良性质。 经过化学修饰的蛋白质不仅较高的维持蛋白质的生物活性，而且能够有效地克服蛋白质免疫性和毒性方面的缺点，同时赋予蛋白质一些新的优良性能。 　　　化学修饰为蛋白质在许多领域的广泛应用提供了一条新颖而有效的途径。 基于DpnI的快速定点突变 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 突变体的产生 易错PCR（Error prone PCR） DNA 搅乱重组（DNA shuffling） 易错PCR（Error prone PCR）是一种相对简单、快速、廉价的随机突变方法。它通过改变PCR反应条件，如降低一种dNTP的量（降至5%-10%）、以dITP来代替被减少的dNTP、增加Mn2+和Mg2+的浓度或使用低保真度的DNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。 枯草杆菌蛋白酶（Subtilisin） 通过易错PCR进行了系列体外进化得到几个在高浓度的二甲基甲酰胺（Dimethylformamide，DMF）中酶活力明显提高的突变株。 三点突变体D60N+Q103R+N218S在85％DMF条件下的酶活力是野生型的38倍。 交错延伸PCR: 是在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步，缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。  随机引物体外重组法: 是用一套随机序列引物，产生互补于模板不同位置的短DNA片段库(由于碱基