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第三章 细胞增殖与调控 韩红兵 1、细胞周期概述 细胞增殖是生命的基本特征，种族的繁衍、个体的发育、机体的修复等都离不开细胞增殖。 细胞增殖是通过细胞周期（cell cycle）来实现的，而细胞周期的有序运行是通过相关基因的严格监视和调控来保证的。 1.1、基本概念 细胞周期：指连续分裂细胞从一次分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的整个序贯过程，又称细胞增殖周期。 100年前发现了有丝分裂(分裂期和静止期) 1953年，howard 和 pelc 用32P标记发现DNA复制发生在静止期的一个区段（有丝分裂的前后存在两个间隙）。 划分四个阶段： ①G1期(gap1)，从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间； ②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期； ③G2期(gap2)，DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； ④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。 细胞周期时间 从增殖的角度来看，高等动物的细胞分为三类： ①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转，因而又称为周期细胞，（表皮基底层细胞、部分骨髓细胞） ②休眠细胞，暂不分裂，在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，（淋巴细胞、肝、肾细胞等） ③终端分化细胞，不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，（神经、肌肉、多形核细胞等） 标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM） 其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。 TdR：胸腺嘧啶核苷，是DNA的特异前体，能被S期细胞摄入，而掺进DNA中。通常使用的是3H或者14C标记的TdR 细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化，前者称自然同步化，后者称为人工同步化。 自然同步化： ①多核体：如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达5-6cm。 ②某些水生动物的受精卵： 如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都同步化进行。 ③增殖抑制解除后的同步分裂： 如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。 选择同步化： 1）有丝分裂选择法：有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，则可获得一定数量的中期细胞。 优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害， 缺点：获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占1%～2%） 2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，可用离心的方法分离。 优点：可用于任何悬浮培养的细胞，缺点：同步化程度较低。 诱导同步化 1）DNA合成阻断法:用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。 抑制药物：5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、5-氨尿嘧啶、高浓度AdR 、GdR、 TdR； TdR双阻断法最常用。 2）中期阻断法：抑制微管的聚合，从而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断在有丝分裂中期。 阻断药物：秋水仙素及秋水仙酰胺，后者毒性较少。 优点是无非均衡生长现象，缺点是可逆性较差。 1.2、细胞周期调控 细胞周期检验点（cell cycle checkpoint） 细胞周期运转有序，依赖于与细胞周期进行的有关基因表达。 细胞分裂有关的基因称cdc (cell division cycle )—受周期中检验点或称调控点调节。 检验点信号转导：起始信号（signal）—感受因子（sensor）—转导因子（transducer）—效应因子（effector） 真核细胞检验点： G1中R点或限制点 DNA损伤检查点 DNA复制检查点 G2/M检验点 纺锤体组装检查点 G1期 G1期中发生的事件与细胞增殖调控有关 连续增殖细胞增值率受G1细胞平均时间控制，细胞周期时间取决于G1期时间长短。 停止增殖的不同细胞，含有G1期DNA含量。 在G1期中存在R点或调控点，细胞处于不利条件不能通过该点。 G1期发生的生化事件： 1）RNA合成量增加，放线菌素D是RNA抑制剂，能够阻抑细胞从G1期进入S期。 2）蛋白合成，环已亚胺为蛋白合成抑制剂，作用于G1期细胞，阻抑细胞向S期前进。 3）重要蛋白合成是G1期细胞进入S期必需的。钙调素—G1期开始积累，G1/S交界处升高，