薄层层析和低压柱色谱技术.pptVIP

薄层色谱和低压柱层析技术 鞠培殿 2009-03-28 一、薄层色谱 主要内容 1、简介 2、制板 3、使用 4、TLC展开剂选择 1、简介 薄层色谱（Thin Layer Chromatography TLC）又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱。 作用：主要用于快速检测目标样品的分离效果；其次用于样品分离，一方面适用于少量样品（几到几微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。 2、制板 1）准备干净的玻璃板：无油和水 2）按硅胶(g)：0.5%-0.7%CMC-Na溶液 （mL）=1：3比例混合，同方向搅拌 至无气泡 3）涂板 4）晾干两天左右备用 1）洗板 2）搅拌 3）涂板 4）晾干 3、薄层板的使用 1）用于检测：将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，间隔0.5-1cm，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下观察。 2）用于制备 就是刮板，这种层析板是普通板硅胶层的2-3倍厚，在点样时点样点间隔1mm，样品溶液不易高，层析结束时有暗斑或荧光的在紫外灯下用铅笔画出标记，按标记刮下硅胶； 没有暗斑的需要在板的中间或两端隔出一条窄缝，显色后将Rf值相同的硅胶刮下，磨碎；准备一个小的层析柱，预装1cm高的柱层析硅胶，先用甲醇冲洗，再用石油醚替换甲醇，将刮下的硅胶装柱后，用和跑板相同极性的溶剂快速冲下。 4、TLC展开剂选择 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油醚己烷苯乙醚二氯甲烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水 使用单一溶剂一般不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂，通常使用一个高极性和低级性溶剂搭配，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有： 石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，石油醚/乙醚，石油醚/二氯甲烷，氯仿/乙酸乙酯，氯仿/甲醇，乙酸乙酯/甲醇 在实际使用时，要尽量使目标物质的Rf=0.5，这样的分离效果最好。 石油醚：丙酮=6：4系统能够最好的区分物质极性大小。 二、低压柱层析 1、硅胶柱层析 2、凝胶柱层析 1、硅胶柱层析 原理硅胶层析的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程。 1.1、 装柱 在空柱内注入一定量的洗脱剂，硅胶（细分时一般是样品质量的10倍，粗分时最低可达到1：1）用洗脱剂溶胀无气泡后尽量一次性倒入层析柱，装完的柱子需要平衡4-5个柱体积，一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。 1.2、上样 湿法上样：将样品溶入尽可能少的低极性溶剂后上样。 干法上样：将与干样品等质量（或更少）硅胶和溶解的样品搅拌均匀，在溶剂挥发的同时不停的搅拌，待硅胶干燥松散后，慢慢加入柱中（硅胶面以上要留有部分溶剂），加入洗脱剂就可以了。 1.3、洗脱剂比例的选择 1、梯度洗脱，一般从小极性溶剂开始，冲10个柱体积或冲至洗脱下才物质种类和浓度不在改变时，换下一个梯度。 2、分离纯化样品时，样品TLC的Rf=0.05-0.1时的展开剂比例可以用做柱层析。 2、凝胶柱层析 原理 凝胶过滤--依赖于分子的大小和形状 吸附层析--依赖于被分离化合物与凝胶之间的氢键数量和质量 分配层析--依赖于被分离化合物在流动相（溶剂）和固定相（凝胶）之间的分配，这主要由样品的极性和溶剂的极性决定的。 展开剂一般选择氯仿：甲醇=1：1， 也有用无水乙醇的 注意： 尽量一天过完 尽量少停（会扩散） 在一定条件下可以改变洗脱剂极性 * * * * *