苏云金芽孢杆菌毒素的生产.pptVIP

苏云金芽孢杆菌毒素的生产工艺 苏云金芽孢杆菌 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，B.t.）于1901年由日本科学家S.Ishwata从家蚕中发现至今已有109年历史。 B.t.已成为目前产量最大、应用最广的一类微生物杀虫剂，占到生物农药生产量和使用量的90%左右。 B.t.杀虫毒素主要有三种 1、伴孢晶体（ICPs）即σ-内毒素。 蛋白质，在昆虫体外与特定的生物膜类脂物相互作用使其重新排列，最终导致细胞溶解。在活体内，因昆虫肠液碱性条件和酶的作用降解成毒性多肽，使昆虫肠上皮细胞的酶功能、蛋白质代谢和运输过程受干扰，或是作为酶的抑制剂和细胞自溶的启动剂造成内质网空泡，线粒体瓦解，最终细胞自溶使昆虫死亡。 2、苏云金素即β-外毒素。是部分B.t.分泌到体外的一类核苷类物质，具有热稳定性和广谱杀虫作用，对蝇类幼虫、夜蛾科和鞘翅目害虫有很好的杀毒作用。 3、芽孢。当受感染昆虫中肠受伴孢晶体损伤后，活芽孢萌发成营养体，穿透肠壁进入血液并大量繁殖，使昆虫患败血症死亡。 分离、发酵、纯化技术 B.t.分离技术主要有以下几种： 土壤分离技术 ：温度筛选、 利用醋酸钠进行选择筛选 、弹土分离法、 抗生素选择性筛选 从植物中分离B.t. 温度筛选 B.t.的芽孢因为中皮层主要成分为肽聚糖和形成过程中产生大量DPA-Ca螯合物而具有耐热性，在80℃下热处理20min也不会死亡，在75℃的亚致死温度下处理15min可以提高其成活率。利用这一特性，可以进行温度筛选。温度筛选范围广，不易漏筛，但是工作量大且B.t.要达到一定浓度。 利用醋酸钠进行选择筛选 B.t.芽孢的萌发直接受pH值影响。加入适量醋酸钠的培养基可以选择性地抑制B.t.芽孢的萌发，经热处理而不被杀死；而其他种类芽孢杆菌因其芽孢萌发，经热处理后被杀死。利用这种筛选分离方法可以消除干扰菌以达到高效分离筛选的目的。 弹土分离法 将土壤样品干燥后研碎，洒在灭菌滤纸上，待滤纸面上沾有一层均匀样品粉末后对着培养皿口轻弹，后培养。该方法简单，但培养后检出的菌类数量大，种类多，不易识别纯化。 抗生素选择性筛选 B.t.较其他芽孢杆菌对抗生素的抗性显著。用抗生素处理后可以有效分离出B.t.，但由于B.t.各亚种之间对抗生素的敏感性不同，个别亚种会因抗生素浓度过高而不能形成芽孢和伴孢晶体，从而造成漏筛。将醋酸钠和抗生素分离法合二为一，可大大提高分离效率。 从植物中分离B.t. 有研究表明，B.t.普遍存在于植物叶面，叶面菌群有高度的血清型特异性，植物物种和B.t.菌株表型不存在相关关系。采用植物微生物分离常用方法，再结合4%NaCl培养基选择分离法、土壤B.t.分离法中的醋酸钠分离法和抗生素分离法等就能分离得到较纯的B.t.。 发酵技术 B.t.的工业生产主要分为菌种培养、发酵、浓缩（离心或板框过滤）、干燥、剂型化、产品检验六道程序。 目前，B.t.的大规模生产主要采用液体深层发酵。 B.t.的最佳培养条件为：在恒温培养箱中，使用液体发酵培养基(胰蛋白胨1．0％，葡萄糖0．5％，玉米粉0．5％，酵母膏0．2％，磷酸氧二钠0．1％ ，磷酸二氧钾0．1％)，l50ml培养瓶中配制25mL培养液，30℃培养36h，振荡频率为250次／min。 固态发酵 固态发酵是B.t.生物农药生产的一种新方式。相较于液体发酵，具有培养基对环境污染少、易处理，能源消耗量低，技术设备简易，产物浓度高，后处理方便等优点。作为一项新型技术，固态发酵还存在着很大的发展空间。 无论是液体发酵还是固态发酵，都需注意培养基中营养物质、pH、温度、含氧量的控制。对于B.t.的发酵生产，还需注意噬菌体的长期污染会降低产量。 杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）的纯化 ICPs粗品的制备： ICPs随着B.t.孢子囊的破裂而释放。用磁力搅拌器搅拌分离培养纯化后的B.t.制成的菌悬液，除去泡沫层中较轻的孢子，重复几次基本除尽孢子后，用超声波处理使ICPs和芽孢均匀分布，离心弃上清液，用特殊试剂处理以消除晶体蛋白酶对晶体的非特异性降解作用后，溶于生理盐水即制成粗品。粗品中残留细胞碎片、不溶性培养基和芽孢，需进一步纯化。 ICPs纯品的制备 ICPs纯品的制备： 目前纯品的制备方法主要有等密度梯度离心法、液体双向分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法、生物物理法等。 等密度梯度离心法 等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂质分离，从而获得纯品。 其常用的密度试剂有蔗糖 、人工聚合蔗糖、碱金属盐(CsC1、NaBr)、碘化密度梯度介质等 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤：配制密度不同的溴化钠溶液(2．8 mol/L、3．