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人类外周血培养和染色体核型分析 人类外周血培养和染色体核型分析 要求： 了解人外周血培养及染色体制备方法。 掌握人类染色体核型非显著分析的方法。 正确识别各组染色体及判断性别。 人类染色体核型（男性）示意图 人类外周血培养和染色体核型分析 主要仪器： （1）? 超净工作台 （2）? 大容量低速离心机 （3）? 二氧化碳培养箱和电热恒温培养箱 （4）? 电热恒温干燥箱 （5）? 水浴锅 （6）? 天平 （7）? 显微镜 人类外周血培养和染色体核型分析 试剂： 培养基（含80% RPMI-1640营养液，20%胎牛血清，每5mL中加1-2%植物血球凝集素和各500单位的青、链霉素） 低渗液（0.075M KCL） 固定液（新配制的甲醇:冰醋酸为3:1） 生理盐水（0.85% NaCL） 人类外周血培养和染色体核型分析 0.5mg/mL秋水仙素溶液（以无菌的生理盐水配制） Giemsa染液（1g Giemsa粉不断添加少量甘油充分研磨，甘油总量为60mL,倒入烧杯中于55-60oC水浴加热2小时，冷却后加入60mL甲醇，混匀后室温放置2-3天过滤，在棕色瓶中长期保存。 * Giemsa工作液（10%）需要新鲜配制（以蒸馏水或1/15M 磷酸缓冲溶液配制） 人类外周血培养和染色体核型分析 0.0125%胰蛋白酶（效价1:250，以生理盐水配制） 0.2M HCL 2.5% Ba(OH)2：新鲜配制并经65oC热过滤 2×SSC（0.3M NaCL + 0.03M 柠檬酸钠） 人类外周血培养和染色体核型分析 实验步骤 1.??? 细胞培养： 按每5ml培养基中接种约0.5ml静脉血（经0.4%肝素抗凝），置于恒温培养箱中37oC培养68-72小时。 人类染色体核型分析 实验步骤------2.???染色体制片： 收获前2-3小时加入0.1ml 5ug/ml秋水仙素（终浓度0.1ug/ml） 混匀后继续培养2-3小时 ? 转入10ml离心管中，以1500-2000转/分钟离心10分钟，去上清液 ? 加入8ml低渗液（37oC预热）将细胞沉淀吹打均匀 ? 放入温箱中37oC半小时 ? 加入1ml新配制的固定液，轻轻混匀后以与前面相同的转速和时间离心，吸去上清液 人类外周血培养和染色体核型分析 实验步骤------2.???染色体制片： 加入8mL固定液并充分将细胞混匀，室温固定至少半小时，重复离心后，去掉上清液 ? 加入新鲜固定液再次固定至少半小时（最好过夜） ? 经离心和去上清液后的细胞沉淀中加入约0.2ml新鲜固定液混匀 ? 细胞悬液滴于预冷的载玻片上（以每张玻片3滴细胞悬液为宜） ? 酒精灯烘烤滴片，冷却后进行分带处理 人类外周血培养和染色体核型分析 根据第五次人类遗传学国际会议讨论通过的内容，1978年发表了ISCN（An International System for Human Cytogenetic Nomenelature）根据规定的内容，非显带方法的人类染色体的核型分析依据如下： 1 染色体相对长度＝单条染色体长度/正常单套常染色体＋X染色体的总长度 2 染色体臂率（比）＝q/p 3 着丝粒指数＝p/单条染色体总长 根据上述三个重要参数，将染色体分成7个组，即A－G组，X染色体长短在C组内，Y染色体长短归于G组内。 思考题： 人类染色体畸变的类型 制片质量的关键步骤 人类染色体组型分析的标准 * * *