三种不同性质蛋白质跑出来结果.docVIP

四、三種不同性質蛋白質跑出來的結果： 左圖 (Fig. 14-a) 之電泳圖為未使用SDS處理之三樣本X,Y, Z所跑出的結果，Z反而向上方之正極趨近，因其帶正電，所以膠體上看不到Z的帶，而X由四小集團組成之分子大於Y，所以Y會跑的較遠而較接近正極，因大分子阻力較大。 右圖 (Fig. 14-b) 為以SDS處理後之樣本所跑出的電泳圖，只有分子量影響泳動率，三樣本皆帶負電，往正極移動，且SDS會解開蛋白質之folding結構，SDS又有加入β-mercaptoethanol，其會打斷peptide間之雙硫鍵，故樣本都是以簡單polypeptide形式去電泳，X被分成四小單元故最小而跑最遠，但跑樣本X之跑道上有出現一小帶，其為處理不完全之X樣本，其還是tetramer，最大故最接近負極，Z最小所以跑最遠而最接近正極。 (a) (b) Fig. 14 (a) Native(b) SDS X為tetramer (分子量：40000×4)，Y(分子量：88000)、Z(分子量：60000)為monomer；pH8.3之情況下：NATIVE PAGE ( X，Y 帶負電；Z帶正電 )；SDS( 皆帶負電 ) 判讀SDS結果數據：內插法作圖 Fig. 15單元體分子量的測定(SDS)，由電泳結果之樣本移動距離依內插法作一線性圖求分子量。 X軸：分子量(kDa) Y軸：泳動率(Rf) 五、蛋白質染色法及原理： 根據結構之特徵(Fig. 16)，即因含有特定side chain而和染劑產生作用，故達到染色效果， 有兩種方法，第一種方法：將硝酸銀溶於硝酸溶液中，產生銀氨錯離子，用此可 染蛋白質中含有Lys部分，銀離子會還原成金屬銀而附著在Lys之side chain上， 產生深褐色反應產物。第二種方法：使用coomassie blue R (red)，調整其pH值， 使其呈藍色，可染Lys及Arg之side chain部分，而達到染色效果。 Fig. 16 兩種主要蛋白質染色法：1. Ammoniacal silver 2. Coomassie blue R 六、電泳膠體蛋白質的溶離：使用little blue tank 直接挖出膠體進行溶離或定序(Fig. 17-a)，使用little blue tank進行電泳(Fig. 17-b)，將溶離出之樣本經通電後會集中在tank一端，有助於吸出並收集(Fig. 17-c)。 (a) (b) (c) Fig. 17 (a) 將有色帶呈現之膠體部分挖出並收集在溶離槽內 (b) little blue tank (c) 通電進行電泳前(上)、後(下)之情況，箭頭代表電泳泳動聚集方向 七、電泳槽及相關設備 (a) (b) (c) Fig. 18 (a) 電泳槽(左)、鑄膠器(右) (b) 轉印三明治(左)、轉印槽(中，右) (c) 供電器 一般電泳使用迷你電泳槽，而SDS使用其專用之電泳槽 肆：免疫轉印法 通電使膠體上之色帶轉印至nitrocellulose上(Fig. 19-a)，先以ponceau染nitrocellulose，確定轉印是否成功，有紅色色帶呈現即表示轉印成功，在以清水洗淨，進而已抗體偵測呈色(Fig. 19-b)。 (a) (b) Fig. 19 (a) 轉印三明治，箭頭代表轉印方向(gel →nitrocellulos) (b) 免疫染色流程 利用抗原抗體結合之原理，原本使用放射線標定於抗體上，後來改為使用酵素，先由一級抗體和轉印紙上的特定抗原結合，此抗原即是要找之peptide，一級抗體可自行製備，通常選擇異源性且分子量上萬之蛋白質去引發抗體產生而可作為一級抗體，再使用一抗一級抗體之二及抗體去和一級抗體結合，其上已標定好酵素，但若先標定一biotin則可達到放大信息的效果，因biotin和streptavidin有很強之結合力，其解離常數為10-20，而streptavidin又能再和另三個biotin結合，此三個biotin尚在各自接一酵素，可放大信息三倍，有時二及抗體上會標定金屬，如：金(Fig. 20-b)，抗體抗原之專一性結合完畢後，加入受質作用，受酵素催化行程不溶性產物而堆積在酵素作用周圍，就能顯示欲