tgfb信号中tgfbrⅱ的突变对膀胱癌侵袭转移的影响及其机制-effect of tgf br ⅱ mutation in tgfb signal on invasion and metastasis of bladder cancer and its mechanism.docx

TGF-β 信号中 TGF-βRⅡ突变对膀胱癌 侵袭转移的影响及其机制 中文摘要 【背景及目的】 转化生长因子 beta 1（TGF-β1）信号通过Ⅰ型和Ⅱ型 TGF-β受体（TGF-βRⅠ 和 TGF-βRⅡ）途径，可抑制肿瘤细胞生长。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞 常常通过 TGF-β受体的下调或者突变，逃避 TGF-β信号对其生长抑制作用。但是， TGF-β1 激活的信号还能促进肿瘤细胞迁徙，具有促肿瘤的作用，这就是著名的 TGF-β“双向”作用。恶性肿瘤细胞如何逃避 TGF-β信号的生长阻滞作用，并促 进肿瘤转移能力，其机制仍不完全清楚。本研究旨在探讨 TGF-βRⅡ的表达和分 子状态在膀胱癌肿瘤中的作用及其机制，以及与临床关系及其意义，为以其为靶 点的肿瘤干预策略提供实验依据。 【方法】 1． TGF-β1 及其 TGF-β受体在多种肿瘤细胞系中的表达检测 1） 应用 Real-time PCR 检测各种肿瘤细胞系（乳腺癌，肝癌，肺癌，胃癌，子 宫颈癌，白血病，前列腺癌，黑色素瘤及膀胱癌细胞）中 TGF-βRⅠ，TGF-βRⅡ， TGF-β1 的表达 2） 应用流式细胞术（FCM）检测 L02，MCF-7，A549，T24，ScaBER 和 BIU-87 细胞表面 TGF-βRⅡ的表达，胞浆中 TGF-β1 的表达 3） 应用细胞免疫组化法（细胞爬片）检测 L02，MCF-7，A549，T24，ScaBER 和 BIU-87 细胞表面的 TGF-βRⅡ的染色程度 2． L02，ScaBER 和 T24 细胞中 TGF-β信号的阻断试验 1）将本室构建的可溶性 II 型 TGF-β 受体（Fc:TβRII；与 TGF-βRⅡ竞争结合 TGF-β1，阻断 TGF-β信号通路）转染至实验细胞中，应用 Western blot 方法 检测细胞上清中 Fc:TβRII 的表达  2） 将 Smad2/3 的 siRNA 转染肿瘤细胞，应用抗 Smad2/3 抗体，Western blot 的 方法检测细胞中 Smad2/3 的表达 3． TGF-βRⅡ对肿瘤细胞生长、细胞活力影响的实验 1）用 PKH-26 将目的细胞染色后，应用流式细胞术检测 48 h 后各组细胞的增殖 水平（用刺激指数表示） 2）应用 Transwell 实验检测肿瘤细胞的侵袭和转移情况，用苏木素-伊红染色后 随机选取五个视野计数 分组：①对照组；②Fc:TβRII 转染组；③TGF-β1 刺激组；④Si-Smad2/3 组。 4． 膀胱癌细胞及组织标本中 TGF-βRⅡ序列测定，及其突变分析 首先，针对 TGF-βRⅡ编码区第 383-2086bp 设计 TGF-βRⅡ的测序引物；应 用 RT-PCR 方法进行 TGF-βRⅡ基因扩增；然后，利用琼脂糖凝胶电泳显示目的 条带，用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒进行产物回收，纯化；送至上海英骏公司 进行序列测定；利用 pubmed 中 BLAST 将测序结果与 TGF-βRⅡ基因序列进行比 对，分析 5. 检测膀胱癌细胞中 TGF-β1/TGF-βRⅡ信号激活的下游通路 1）应用 Western blot 检测 TGFβ 经典信号通路中的 Smad 磷酸化形式 pSmad 蛋白 的表达 2）应用 IP（免疫共沉淀）检测 TGF-βRⅡ复合体与 Smad 的结合 3）在 TGFβ1（2 ng/ml）刺激 0 h, 2 h 和 4 h 不同时间段，应用 Real-time PCR 检 测 L02，ScaBER 和 T24 细胞中增殖相关基因 p15，细胞分裂周期蛋白 Cdc25A 及促迁移活性的转录因子 CUTL1 的表达 4）在 TGFβ1（2 ng/ml）刺激 0 h, 4 h 和 8 h 不同时间段, 应用 Western blot 检测 实验细胞中增殖及侵袭转移相关基因的表达 6．从膀胱癌标本中分离原代细胞后，检测 TGFβ 信号对 TGF-βRⅡ突变群（a） 与未突变群（b）生物学特性的影响 1）从膀胱癌组织标本中分离原代膀胱癌细胞 2）应用免疫组化试验检测 a 组和 b 组细胞表面 TGF-βRⅡ的表达 3）利用 FCM 检测膀胱癌原代细胞的增殖能力（SI）  分组：①0 h 对照组；②24 h 对照组；③24 h 刺激组（TGF-β1） 4）利用 Transwell 侵袭转移试验检测膀胱癌原代细胞的活力和迁移能力； 分组：①对照组；②TGF-β1 刺激组；③Fc:TβRII 转染组 5） 利用 RT-PCR 检测 TGF-β1 刺激 0 h, 2 h 和 4 h 后，a,b 两组中 p15, Cdc25A 和 CUTL1 的表达 【结果】 1．TGF-β1 在大多数肿瘤细胞中过表达，而 TGF