tfpi-2参与sh-sy5y细胞化学缺氧调控机制的研究-tfpi - 2 participates in the regulation mechanism of sh - sy5y cell hypoxia.docx

目录中文摘要….…………………………………………………………1英文摘要..………………………………………………………………4英文缩写..………………………………………………………………8研究论文TFPI-2参与SH-SY5Y细胞化学缺氧调控机制的研究前言…………………………………………………………………9材料与方法………………………………………………………...11结果………………………………………………………………...23附图………………………………………………………………...25附表………………………………………………………………...32讨论………………………………………………………………...35结论………………………………………………………………...38参考文献…………………………………………………………...39综述microRNA与脑缺氧损伤……………………………………...42致谢……………………………………………………………………53个人简历……………………………………………………………….54TFPI-2参与SH-SY5Y细胞化学缺氧调控机制的研究摘要目的：缺氧损伤见于多种中枢神经系统疾病，如脑梗死、脑出血、脑肿瘤、高原脑水肿等等。研究发现，缺氧可以引起脑部一系列功能蛋白和基因表达的变化，如脑红蛋白等等。其中缺氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor，HIF）是目前已知的介导缺氧过程最重要的核转录因子，可以调控上百种基因的表达。HIF调控的缺氧通路广泛参与能量代谢、细胞周期调节、血管生成、细胞凋亡和肿瘤侵袭等病理过程，是缺氧过程中重要的调控因子。到目前为止，脑缺氧损伤的机制和调控通路并不完善，探索脑缺氧损伤新的调控因子，进一步完善缺氧通路，可以为我们提供神经保护的新靶点，对于脑部缺氧性疾病的预防和治疗具有重要意义。为寻求新的缺氧相关标志性因子，本课题组利用基因芯片及miRNA芯片等技术对低压缺氧大鼠脑皮质进行差异因子的检测，发现了TFPI-2和miR-92a-2这两个具有靶向关系的差异表达因子，其中TFPI-2表达与缺氧呈正相关，miR-92a-2则相反。组织因子途径抑制物-2（tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2）是一种天然的抗凝因子，是内源性TF抑制物，属Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制家族。TFPI-2是一种广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以抑制包括纤溶酶、基质金属蛋白酶等在内多种蛋白酶的活性，维持细胞外基质的完整性。研究发现，TFPI-2参与多种恶性肿瘤的转移和侵袭过程，与肿瘤组织血管生成、细胞凋亡等过程密切相关。但是TFPI-2在缺氧过程中的变化及调控机制没有得到充分研究，TFPI-2是否通过HIF经典途径参与细胞缺氧损伤也并不清楚。氯化钴是常用的细胞化学缺氧诱导剂，可抑制HIF-1α降解，激活HIF缺氧通路，模拟细胞缺氧环境。本实验拟通过建立SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞氯化钴化学缺氧细胞损伤模型，探究TFPI-2在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞缺氧损伤中的变化及可能的调控机制。方法:1CoCl2缺氧对SH-SY5Y细胞活性和形态的影响1.1培养SH-SY5Y细胞，加入不同浓度CoCl2（0、100、200、400μmol/L）处理细胞，分别在6小时和24小时通过倒置显微镜观察细胞生长状态，对细胞进行HE染色，观察细胞化学缺氧前后形态变化。1.2使用不同浓度CoCl2（0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500μmol/L）处理SH-SY5Y细胞，利用MTT法检测细胞活性变化。1.3用100μmol/LCoCl2处理SH-SY5Y细胞，MTT法检测缺氧不同时间（0、6、12、24、48、72小时）细胞活性变化。2CoCl2缺氧前后SH-SY5Y细胞TFPI-2、miR-92a表达水平检测利用Westernblot技术，检测100μmol/LCoCl2缺氧不同时间（1、2、4、6、8小时）SH-SY5Y细胞HIF-1α和TFPI-2、VEGF表达水平，对氯化钴化学缺氧后基因表达变化趋势进行分析。Real-timePCR法检测100μmol/LCoCl2缺氧8h后HIF-1αmRNA、TFPI-2mRNA和VEGFmRNA表达变化。Real-timePCR法检测100μmol/LCoCl2缺氧8h后miR-92a表达变化。3YC-1预处理对SH-SY5Y细胞缺氧后TFPI-2表达的影响3.1用10μmol/L、100μmol/LYC-1预处理细胞2小时，对照组加入相同浓度的DMSO培养2小时，然后加入100μmol/LCoCl2共培养细胞8h，EdU法检测各组细胞增殖活性变化。3.2Westernblot