S蛋白表达和细胞定位.docVIP

Sars－Cov M，N,S蛋白的表达和细胞定位 生命科学学院00级 陆文 摘要 在获得Sars-Cov的结构蛋白S,M,N的cDNA的T-Easy克隆之后,通过限制性内切酶处理后连接到表达载体上,然后通过bac-to-bac杆状病毒表达系统,把结构蛋白的DNA转座到bacmid中,转染昆虫细胞,包装出第一代病毒后,用重组病毒感染昆虫细胞,从细胞中纯化到Sars-Cov的结构蛋白.由于在PCR的设计的引物中在DNA末端加入标记,可以利用标记的抗原性用western blotting检验得到的纯化蛋白.在昆虫病毒感染重组病毒48h之后,免疫荧光制片,观察蛋白在细胞中的分布.同时,将克隆到荧光蛋白载体的M,N,蛋白和真核表达载体的S蛋白转染真核细胞,通过荧光蛋白的分布或免疫荧光确定M,N,S蛋白在真核细胞中的分步. 关键词：Sars-Cov, Sars-Cov结构蛋白,M,N,S蛋白,转染,western blotting,免疫荧光。 前 言 冠状病毒科的成员只感染脊椎动物,与多种动物和人的疾病有关,本科病毒具有胃肠道,呼吸道和神经系统嗜性,分别引起相应的症候群. 冠状病毒为多形态,略成球形,直径80-160nm.有囊膜.病毒囊膜由双层脂质组成,在脂质双层中穿插有两种糖蛋白:膜蛋白(M,又称E1)和纤突蛋白S(又称E2).囊膜表面覆有长12-24nm的突起(即纤突),纤突末端呈球状,由于囊膜纤突规则的排列呈皇冠状,冠状病毒的名称即由此而来.病毒粒子内部为RNA和核衣壳蛋白(N)组成的核蛋白核心,呈螺旋式结构,直径9-16nm. 存在于病毒粒子囊膜上的糖蛋白具有不同的功能:M蛋白 (20-30KD)是一种转膜糖蛋白,它通过3个疏水α-螺旋区3次插入脂质双层,故其大部分(85%)位于囊膜内部,仅有N端糖基化的小部分暴露在囊膜的外面.M的功能类似正粘病毒,副粘病毒以及弹状病毒的非糖基化蛋白,在病毒装配期间将核衣壳连接到囊膜上,另外,抗M抗体在补体存在时可中和病毒感染性.S糖蛋白(180-200KD)大部分暴露在脂质层外面,是构成囊膜突起的主要成分.它由2个同样大小的多肽组成,S蛋白能直接与宿主细胞表面的受体结合,引起细胞融合,并具有诱导产生中和抗体和介导细胞免疫等功能. 图1 冠状病毒 ’末端具有帽结构,3’末端含有结合的poly A尾.在正股5’末端的非编码区和负股5’末端之间有明显的同源序列.比较不同mRNA基因之间的同源性发现,基因组RNA5’末端序列与不同mRNA基因之间的序列有高度的同源性,都有UAAAC序列,在先导RNA序列与基因内部起始位点之间有7-18个核苷酸是相同的,这些序列的特点与冠状病毒的先导-引物转录有关.目前已经证实,冠状病毒基因组RNA具有很高的重组率,这一现象类似分节段的RNA病毒,如呼肠孤病毒. 在感染过程中，冠状病毒和细胞的吸附过程主要与细胞表面的特异性受体及病毒的纤突有关.病毒侵入细胞的方式有二:一为细胞对病毒的吞饮,一为病毒囊膜和细胞膜的融合.冠状病毒在感染敏感细胞后,于胞浆内发生脱壳,随后正链基因组RNA活化,呈现mRNA的作用,首先指导早期翻译病毒特异性RNA聚合酶,由此复制出互补的负链RNA.在转录酶参与下,由负链RNA转录出正链RNA和许多编码病毒蛋白的mRNA,他们具有相同的3’末端和65个核苷酸的5’端先导序列,分别编码结构蛋白M,S,N和非结构蛋白(NS).核衣壳的装配发生在胞浆的病毒工厂(毒浆)内,并在内质网和高尔基体之间的囊状膜上出芽成熟.冠状病毒看来并不在细胞膜上出芽,虽然有时可在胞膜上内发现病毒特异性抗原.聚集在感染细胞胞浆空泡内的病毒粒子,借助空泡和细胞膜的融合或在细胞崩解时释放到细胞外. Sars(severe acute respiratory syndrome)病毒是一种新的冠状病毒,全基因组由29,727个核苷酸组成,具有11个开放阅读框,基因组结构与其它冠状病毒相似,基因序列与原先发现的冠状病毒的同源性不高. 图2 ORFa/b示意图 SARS病毒基因组中总共找到了11个CDS，coding sequence）,序列比对的结果显示从第250位核苷酸开始编码的,长度为7074个氨基酸的多肽1ab多聚蛋白，和鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus)的相应片断很相似,根据已有的鼠肝炎病毒相应片断的知识,将1ab多聚蛋白又分成14个蛋白,其中包括.另外一个CDS()，就是1ab多聚蛋白的前4383个氨基酸.其它9个CDS中有4个在BLAST中找到了高度同源的序列,分别对应于S M蛋白、E蛋白、和N.5个没有找到任何同源的序列.所以推定SARS病毒总共有23个蛋白质.Krueger et al., 2000).Spi