基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍.pptVIP

五、基因定点诱变 定位诱变技术就是指按照设计要求，在体外将基因特定区域的碱基进行突变，这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传分析，以便于研究基因结构与功能的关系和基因表达调控的过程。其诱变技术有两种类型，即区域随机诱变和点突变。 ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术 1.盒式诱变（casette mutagenesis） 利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。 2.寡核苷酸引物诱变技术 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA的复制，新产生出来的心链就具有已发生突变的碱基序列。 ㈡ PCR点突变技术 1.重组PCR定点诱变法 该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来进行的。操作较为繁琐。 2.引物PCR定点诱变法 该方法是利用三种引物，两轮PCR反应来进行的。 六、DNA与蛋白质互作分析 外源基因的功能分析涉及蛋白质与DNA的互作分析。 主要方法有： 酵母杂交系统 凝胶阻滞实验 DNaseI足迹实验 甲基化干扰试验 体内足迹实验 一）酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system) 1. 原理： 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）。 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 2.实验过程 1）首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录因子BD编码区的表达载体上。 2）导入酵母细胞中使之表达带有BD的杂蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。 3）此时，若将AD的DNA与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得“猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母细胞。 4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。 5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互作用的新基因。 原理： 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。 * 顺式作用元件 真核生物DNA序列（非编码序列）和被转录的结构基因距离较近，和转录调控有关。 A 启动子（启动子上游近侧序列） B 增强子 C 沉默子 启动子（promtor）在转录起始点上游约100－200bp以内，每个元件长度约为7－20bp，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件。 增强子(enhancer)能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。 沉默子(silencer)负性调节元件，与相应的反式因子结合后，可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。 三）凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA） 是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术 原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。所以，当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。 四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing） 主要步骤：① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；⑤进行DNA凝胶分析。 ? ? 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。 ?? 用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合