重组体构建过程.docVIP

重组体构建过程 主要分五个过程：分、切、接、转、筛，具体为： 选择用于基因克隆的DNA材料及获取带有目的基因的DNA片段； 将带有目的基因的外源DNA片段与载体分子分别进行酶切，通常为双酶切，以便形成正确顺序的连接； 将酶切后的线性载体分子与目的基因片段在体外进行连接，形成重组DNA分子； 将重组DNA分子导入合适的宿主细胞； 筛选、鉴定并扩增获得了重组DNA分子的宿主细胞。 每个过程详述如下： 分 选择具有抗性基因及多功能酶切位点的质粒，如，PGL3-basic， pEGFP-C1/G1，等。 扩增所需的目的基因片段： ①. 从pubmed, Nucleotide栏内搜索到需要构建的目的基因片段，即基因的mRNA序列；若要构建报告质粒，则从Gene栏内选择基因的某一段序列，如可能的启动子序列区，并且此序列区含有此基因的一段mRNA序列。 ②. 设计带有合适的限制性内切酶位点的正向及反向引物，并从公　司合成。可从primer premier或其他软件上设计，同时选择引物两端的酶切位点，最好选择两个不同的酶切位点。引物设计时尽可能避免应用所扩增的DNA片段内部存在的限制性内切核酸酶位点作为引物导入靶基因两端的克隆位点，即所选的酶不能将目的基因切断。另外，设计引物时应严格按照引物设计的基本原则，一般还应在引物的5，端加上几个保护碱基（通常为3个）。 ③．扩增目的基因： 若克隆的是一个基因的mRNA序列，则从含有丰富此基因的组织细胞中提取RNA，反转录为cDNA，通过PCR反应扩增此目的基因； 若要构建报告质粒，则需要提取基因组DNA，通过PCR反应扩　增此目的基因。 ④．目的基因片段经PCR反应扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行胶回收纯化目的基因片段。 切 建立双酶切反应体系，对所选用的质粒DNA及扩增的目的基因片段进行双酶切，一般37°C酶切过夜；若用快速酶切，则按照说明书进行操作。 注意：酶切的质粒DNA及目的基因片段需要选择等量或定量，如各酶切500ng或1ug。 将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，对酶切片段进行胶回收，并测　其浓度。 三. 接 1. 选择载体与插入片段的摩尔浓度比，参照分子克隆书籍或分子生物学技术书籍，一般为1:1～1:8；载体与插入片段比推荐使用公式如下(本科室生物学技术书第 页)： 载体ng数乘以插入片段kb数除以载体kb数再乘以插入片段与载体的摩尔比就等于插入片段ng数 2. 建立连接体系：通常按照所使用的连接酶说明书建议的体系设立，并需设立阴性对照，即一个连接体系中仅有载体的酶切产物，而没有目的基因片段的酶切产物。 　 3. 通常20ul 连接体系需16℃连接过夜，或依照说明书进行操作。 四． 转 1. 将连接产物进行转化，通常连接产物转化的细菌克隆要比阴性对照组克隆多，若克隆数接近，则为酶切不完全，连接失败。 2. 挑选阳性克隆于含适当抗性的LB 培基中扩增，同时可做菌落PCR鉴定。 五． 筛 1. 对所扩增的阳性克隆进行鉴定： 对所挑选的阳性克隆扩增的菌液，提取其质粒DNA，进行双酶切鉴定，鉴定结果一般为三条带或两条带： 三条带的为双酶切不完全，每条带的正确长度应为：载体加目的基因片段长度、载体长度及目的基因长度。 两条带的为双酶切完全，两条带的长度各为：载体长度和目的基因长度。 　2. 对酶切结果正确的阳性克隆要进一步送公司测序，鉴定其正确性。 3. 对以上鉴定正确的阳性克隆进行大量扩增，提取其质粒，以备后续实验用。 Realtime PCR 将等量RNA（通常为1ug）通过逆转录得到的cDNA，一般为20ul 体系，稀释5倍到100ul 用于Realtime PCR 反应模板。 配cDNA混合液（mix），在配cDNA-mix之前，要先看有几个cDNA，做几个引物，安排好整个体系所需的孔数，一般均需做复孔。 　例如：有三个cDNA，四个引物，则应安排为： cDNA-1 cDNA-2 cDNA-3 引物1 ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ 引物2 ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ 引物3 ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ 引物4 ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ 3. 这样，cDNA-mix 就应该配成9×，若Realtime PCR 体系为10ul， 则应配制为： SYBR 5ul 45ul cDNA 1ul 9ul ddH2O 3ul 27ul 上样时每孔9ul。 4. 先将引物1ul 加