中国药品检验标准操作规范2010年版28荧光分析法.docVIP

荧光分析法 1 简述’ΦI0（1-e-εbc） 式中，F是荧光强度，K’是仪器常数，Φ是量子效率，I0是激发光强度，ε是摩尔吸收系数，b是样品池光程，c是样品的浓度。 由式可见荧光强度与仪器条件有关，因此供试品必须与对照品在相同条件下测定。 2 仪器和用具、溶剂 2.1 仪器 荧光分析法所用的仪器为荧光分光光度计或荧光计，它由激发光源、激发单色器和发射单色器、样品池、检测器及记录仪表组成。 光源：多采用高压氙灯，它在紫外光区和可见光区都能给出连续辐射（220~700nnm）。 单色光器：由光栅和狭缝组成。有两组，一组为激发单色器，光源的连续辐射经激发单色器得到单色光照射到样品池，供试品溶液经激发光照射后产生的荧光则常以与激发光源呈90°的角度照射到发射单色器，发射单色器分光以后照到光电倍增管转换为电信号，送入显示或记录仪表读数或记录。 样品池：常用石英池，质地应较纯，不含荧光性杂质，固定受光面标志。如拟配对使用，则可盛稀硫酸奎宁溶液（1×10-8g/ml），激发波长350nm，发射波长450nm，调节仪器示值为95%，选取各池荧光强度相差不大于1.0%者成对使用。 仪器的使用按各仪器说明书进行操作，通常应在光源点燃及主机预热20min后再进行测定。 2.2 仪器的性能检测 荧光分光光度计，各仪器厂商有其自订的技术指标，国家技术监督局颁布有“JJG537-88荧光分光光度计试行检定规程”，对其技术性能有多项具体规定。 2.2.1 波长准确度 可将发射单色器置零级位置，在灯室内安放笔型汞灯，并将漫反射板校正具放入样品室，选择分布均匀的5条谱线作参考波长，记录其最大读数时的波长为测量值，与已知波长值进行比较，或用氙灯的450.1nm谱线检查，其波长准确度应符合于技术指标所规定。 2.2.2 灵敏度（信噪比S/N） 采用水的拉曼谱线测定，可置激发波长为350nm，激发和发射单色器狭缝为10nm，用二次蒸馏水，调节灵敏度使发射波长为397nm时，仪器示值在40%左右，发射波长退回到300nm，调仪器零位，扫描发射波长，记录300~430nm发射光谱曲线，发射光谱397nm附近的峰值即为S，然后在峰值处记录2min，记录噪声曲线最大的峰-峰值即为N。 灵敏度应符合于其技术指标。 其它技术指标如分辨率、线性误差、稳定度等，可参照JJG537-88检定规程。 2.3 用具与溶剂 玻璃仪器：荧光法因灵敏度高，影响因素也多，所用的玻璃仪器与测定池，必须保持高度洁净，应无荧光物质污染。 蒸馏水：要用双重蒸馏水。 溶剂：要用较高纯度，必要时应预处理以消除其中存在微量荧光物质或可致降低荧光强度的成分。如溶剂的干扰在欲测波段及测定条件下影响可以忽略，也可只用简单的处理或事先作空白对照试验。 3 操作方法和注意事项 按各品种项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并配制对照溶液和供试品溶液，按仪器说明进行操作，通常选用四面透光、无荧光的1cm×1cm石英小池进行测定。 3.1 配制好溶液，转移到荧光分光光度计用的石英池中，按各品种规定用单色波长的激发光束进行照射，在荧光的规定波长处测量其发射光的强度。 3.2 定量测定时，由于不易测定绝对荧光强度，故常见的分析方法都是在一定的条件下，用对照品溶液测得浓度的线性范围后，按以下步骤测定。 3.2.1 以配制供试品溶液的溶剂作空白，调节零点。 3.2.2 按规定取标准溶液或最浓的1份对照品溶液，测定荧光强度，调节仪器的灵敏度使荧光强度接近最大。 3.2.3 读取对照品溶液及其试剂空白与供试品溶液及其试剂空白的读数，按计算公式得出供试品的浓度。供试品及对照品应各取2份，平行操作。 3.2.4 有些易被光分解或弛豫时间较长的品种，为使仪器灵敏度定标准确，应避免激发光过度照射，即适当采用较小的入射狭缝，并尽可能缩短激发光照射供试液的时间。必要时可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液，例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等。先与对照品溶液比较测定其读数关系，并在测定供试品溶液时，用以代替对照品溶液以校定仪器的灵敏度。通常可将此种物质溶液荧光强度调整读数为100。 3.3 注意事项 3.3.1 溶剂及所用玻璃器皿，应高度纯净，操作中注意防止荧光污染。 3.3.2 荧光仪器上所用的石英样品池质量较好，应不含荧光性杂质，不可与其它仪器混用，使用前后，注意清洗，保持洁净。 3.3.3 荧光仪器在测定时打开光照闸门，读数以后应立即关闭光路，因样品溶液的较长时间光照，将使荧光效率降低，受光检测器光电管也易疲劳老化。 3.3.4 供试品溶液的浓度，药典品种正文上虽已有注明，但荧光仪器由于