蛋白质2011 (NXPowerLite).ppt

可逆沉淀 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从溶液中沉淀分离, 沉淀过程中，蛋白质结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，故这种沉淀又称为非变性沉淀或可逆沉淀。 可逆沉淀的方法:等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 不可逆沉淀 沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀或不可逆沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀蛋白质的方法 A.盐析法 高浓度的中性盐[（NH4）2SO4、 NaCl]，使蛋白质脱去水化层，聚集沉淀 B.有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数 C. 重金属盐沉淀 Hg2+、 Pb2+、Cu2+ D. 生物碱和某些酸类沉淀法 pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成沉淀 生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸 E. 加热变性沉淀（通常不可逆） （4）蛋白质的变性 天然蛋白质因受物理、化学因素影响，使蛋白质分子的构象发生异常变化，从而导致生物活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性 (denaturation)。 a.蛋白质的变性 蛋白质变性后的现象： ①结晶及生物活性丧失。 ②疏水侧链基团外露，分子结构伸展松散。 ③理化性质改变，溶解度降低，沉淀，粘度增加。 ④生物化学性质改变，易被蛋白酶水解。 b.引起蛋白质变性的主要因素 温度（热、冷） 还原剂（β-硫基乙醇） 强酸、强碱 尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应） 表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS） (应用)消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温 盐析：加入中性盐，破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出。 常用的有：硫酸铵、氯化钠等 各种蛋白质盐析时，盐浓度和ph不同 分离蛋白：等电点附近时盐析，效果较好 重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子结合成盐沉淀 沉淀条件：ph稍大于等电点 生物碱及某些酸类 生物碱（苦味酸、鞣酸） 酸：硝酸、三氯乙酸 沉淀条件： ph稍小于等电点 有机溶剂沉淀蛋白质 与水混合的有机溶剂（丙酮，酒精等），对水亲和，破坏蛋白质颗粒的水化膜 应用：常温变性 低温分离 加热变性 等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质凝固。 变性 沉淀 凝固 等电点 c.蛋白质的复性 变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation） 三级（或四级）结构被破坏时，往往引起可逆变性 二级及三级（或四级）结构一并破坏时，往往引起不可逆变性 （5）蛋白质的紫外吸收 Trp、Tyr和Phe在280nm 附近有最大吸收。因此，利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。 蛋白质的显色反应 茚三酮反应 紫色络合物 脯氨酸 黄色 双缩脲反应 紫红色 米伦反应———米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液），首先沉淀，然后加热有红色沉淀 含酪氨酸的蛋白质均有米伦反应 2.3.5蛋白质的分离纯化 目的：蛋白与非蛋白分开 蛋白质之间分开 上清 匀浆 线粒体 微粒 细胞核 纯化步骤： （1）前处理 破碎细胞、选择提取介质(缓冲液合适浓度和Ph)，保持天然状态 （2）粗分级 分开目的蛋白与较大量的杂蛋白 （3）细分级 分开目的蛋白与结构相似的杂蛋白 （4）结晶 进一步提纯的过程 确定蛋白质处于天然状态的指标 （一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀法 等电点沉淀法—蛋白质在等电点溶解度最低 调节混合溶液的ph值，分离目的蛋白 盐析法 加入中性盐达一定饱和度，可使目的蛋白析出（硫酸铵best~~~溶解度大，不易引起变性） 有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮，使蛋白质分子中相反电荷间的吸引力增强、脱去水化膜。蛋白质易于凝集而沉淀 （二）根据 分子大小和形状的差异分离 ①透析和超滤法：除去小分子物质 半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。 施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子 超过滤 沉降的速度与颗粒的大小和密度有关。 离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析 ②密度梯度离心法 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。 凝胶过滤层析的原理: 介质