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第七章 现代生物学技术在蛋白质工程中的应用 ;传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹 技术、酶联免疫吸附测定（ELISA） 新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术；用于功能蛋白质筛选的表面展示技术 ;第一节 表面展示技术;概念;一、噬菌体展示技术 ;;;Phage structure:;;Fiber structure; 1 原理;噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。其建立基于三个原则： 在衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）的 N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋白的天然构象，并能被相应的抗体或受体所识别 。;利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体； 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。;展示文库的特点;目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有： 丝状噬菌体展示系统 λ 噬菌体展示系统 T4 噬菌体展示系统 T7 噬菌体展示系统 其中，T7 噬菌体系统可以高、中、低拷贝展示不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展示系统。 ; 单链丝状噬菌体展示系统 P III 展示系统，主要用于获得高亲和力的克隆，形成单价表面展示体系 P VIII 展示系统，主要用于筛选亲和力较低的克隆，形成多价表面展示体系 P VI 展示系统 ;;应用的基本原理——（Panning) ;Panning processing;2 应用;（2）噬菌体展示技术与抗体工程 噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入第三次革命。噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体。 ;将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（phage antibody library）。;（3）生产高效低价疫苗 它能方便地大量生产疫苗用抗原表位，可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗。;（4）研究诊断用疫苗 （两种情况）;2 在预先不知道诊断用靶抗原的情况下，使用患者血清从抗原决定簇库中筛选出展示特异性抗原决定簇的噬菌体，这种噬菌体只能与病人血清抗体反应，而不能与正常人的血清反应，从而建立起疾病的特异性诊断方法。;(5)筛选酶抑制剂 Norgren等利用该技术筛选到了7种酶系种的6种抑制剂，Dennis从肽库中筛选到能非竞争性地抑制丝氨酸蛋白因子VIIa活性的肽段;3 噬菌体展示技术的局限性 ;(3) 噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。 由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。 从建库开始，密码子的选择与寡核苷酸的合成，即编码肽的基因就带有一定的偏爱性，这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局限性。;;二、核糖体展示技术与 mRNA 展示技术 ;核糖体展示技术的基本原理 ;核糖体展示的过程;mRNA 展示技术的原理;嘌呤霉素是一种分子质量小、化学性质为稳定的氨酰tRNA类似物。当3‘端带有嘌呤霉素连接子的mRNA在体外翻译系统中完成翻译时，嘌呤霉素模拟tRNA末端的氨酰基结构，进入核糖体的A位点，抑制了蛋白质的翻译，在新生肽链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成稳定的酰胺键，使mRNA 的3’端与多肽的羧基 端共价结合起来。 ;三、细菌表面展示技术 ;原理;流式细胞仪结合细菌表面展示技术具有以下几个明显的优点： 能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。 与噬菌体肽库相比，细菌展示肽库还可用荧光激活细胞分选技术（FACS）进行更快速更高效筛选 。;细菌表面展示文库FACS筛选原理示意图 ;目前已有的多种细菌表面展示系统;四、酵母表面展示技术 ;1 目的蛋白-α凝集素表面展示系统 ;迄今，已经有多个应用α凝集素的 C 端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是α-半乳糖苷酶（如图 ）。 ;2 a凝集素-目的蛋白表面展示系统;a-凝集素的组成;;酵母表面展示技术的应用;第二节 蛋白质分析鉴定技术 ; 1 蛋白质芯片的概念 ;2 蛋白质芯片的分类;蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片段抗体、受体等固定在载体上，制备检测芯片用以识别