组织提取DNA方法.docVIP

组织提取DNA方法：(提取方法来自重点室) 1取组织于1.5mlEP管中，加裂解液500μL，10 ulPK（20mg/L）μL至1.5ml EP管 2加10μLOB蛋白酶和250μL Buffer BL.加4μL Linear Acrylamide ，Vortex 最大速度，15s. 3 孵育10min 65℃. 4 孵育期间短暂vortex 5加260无水乙醇至血清中，vortex 最大速度，20s.短暂离心 6换亲和柱，将血清上柱，8000g,1min,弃穿流液 7将柱子至2ml 新管，加500μLHB Buffer,8000g,1min,弃穿流液 8将柱子至2ml 新管，加700μL DNA Wash Buffer(已用乙醇稀释)，8000g,1min,弃穿流液 9将柱子至 新管，加700μL DNA Wash Buffer，8000g,1min,弃穿流液 10将柱子至2ml 新管,15000g,2min,空甩 11将柱子至1.5ml 新管，加50-100μL,65℃预热的Elution Buffer,室温放置5min 12洗脱DNA,8000g,1min.保留穿流液。将柱子至1.5ml 新管，重复11-12步。弃柱子，储存溶解的DNA于-20℃ PCR反应条件 94℃ 30`,预变性94℃ 2` 退火温度55℃ 2` 延伸72 30` (35×),72℃ 10min PCR 体系成分（总体系为20微升） 　 　 模板 左引物 右引物 Taq 酶 dNTP MgCl2 总体系 Buffer 工作液浓度 　 25uM/ul 25uM/ul 5U/ul 2.5mM 25mM 20微升 　10× 加样量 1ul 0.4ul 0.4ul 0.1ul 1.6ul 1.2ul 2.0ul H-1 KRV 如图：1、2孔加样量为1 ul,3、4孔加样量为2 ul,5、6孔加样量为3 ul,7孔为阴性对照，8孔为空白对照，Maker 大小为2000bp. （QIAGEN试剂盒） 全血DNA提取 1) 实验前准备：将全血样本、蛋白酶K恢复至室温并准备56℃水浴。 2) 将20μl 蛋白酶K加入1.5ml离心管底部。 3) 将200μl样品（全血或5×106淋巴细胞）加入离心管中，适度混匀。 4) 将200μl AL液加入离心管中，震荡混匀15秒。 5) 56℃水浴孵育10分钟。注意：过高温度或过长时间会导致DNA的降解。 6) 将1.5ml离心管短暂离心，以消除粘在管壁的液滴。 7) 将200μl无水乙醇加入离心管中，震荡混匀15秒，短暂离心。 8) 将混合液移入核酸提取柱中，8000rpm，1min离心。换新的套管。 9) 将500μl AW1液加入提纯柱，8000rpm，1min离心。换新的套管。 10) 将500μl AW2液加入提纯柱，8000rpm，1min离心。换管后全速3分钟。 11) 将提纯柱置于新的1.5 ml离心管中,将200μl 预热至56℃的灭菌水加入提纯柱中,室温孵育5分钟后8000rpm，1min离心将核酸样品洗脱。 12) 取3μl样品琼脂糖凝胶电泳，用紫外分光光度计检测提取核酸的质量。