第八章 哺乳动物细胞克隆.ppt.pptVIP

哺乳动物的克隆 本章主要内容 8.1 动物克隆技术发展简史与意义 克隆定义 克隆(clone)的音译，原意指用于扦插的枝条，也即无性繁殖。1963年Haldane最先使用“clone”, 至世纪70～80年代，克隆一词开始广泛使用。 遗传学定义的“克隆”:指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体，通过无性繁殖而形成的群体。在不发生突变的情况下，它们具有相同的遗传结构。 “克隆”分为分子克隆、细胞克隆和个体克隆三个层面。 在分子层次上，---“分子克隆”。将DNA片段插到一个载体中，在宿主细胞中自我复制。 在细胞层次上，---单克隆抗体。指由一个单一的共同祖先细胞所形成的一个细胞“群体”。 在个体层次上，克隆是指基因型完全相同的2个或更多个体组成一个“群体” 。 1997年，世界卫生组织（WHO）解释克隆：克隆为遗传上同一的机体或细胞系（株）的无性繁殖。 8.1 动物克隆技术发展简史与意义 8.1.1 简史 由“胚胎分割”开始。1978年，建立了卵裂球分离和桑葚胚分离技术。之后对胚胎分割程序简化和提高胚胎分割效率研究；现已发展到不依赖于显微操作，而在实体显微镜下操作的胚胎分割。 在胚胎分割基础上，开始“细胞核移植”研究。“细胞核移植”才是技术含量最高的动物克隆。 1938年，Spemann提出以核移植生产克隆动物的设想开始，1952年，产生了世界上第一种克隆动物－非洲豹蛙； 1963年，我国胚胎学家于克隆出亚洲鲤鱼； 1997年Wilmut等利用成体细胞核移植技术获得克隆绵羊“Dolly”，在动物克隆研究领域取得了重大突破。 迄今为止，动物克隆在各国如火如荼，成功克隆的动物有20余种，包括鱼、羊(绵、山羊)、老鼠、猫、狗、牛、马、兔子、骡子、猪、狼、猕猴等。 20余种克隆动物大盘点 图8-5　耳上皮细胞克隆羊”阳阳”左和其原型”青青” 克隆骡子：“爱达荷宝石” 2003年5月29日,美国科学家宣布克隆了一头骡子，为世界范围内第一次克隆出马科动物，也是克隆杂种动物的首次成功尝试。 方法：从骡子胚胎细胞核内提取DNA（脱氧核糖核酸），将其与去核的马卵母细胞细胞结合.形成杂种胚胎。 该成果意义:首先,有助于克隆其他自身繁殖有困难的濒危动物;其次,对研究癌症等疾病有重要的参考价值。一些癌症患者细胞内Ca2+含量异常高。而马科动物细胞内的钙含量比人低,已识别出其细胞中含有一种化学物质,能够抑制细胞内钙含量增高。 8.2 产生遗传相同个体(克隆）的原理与方法 胚胎分割 细胞核移植（包括连续细胞核移植或继代核移植或重复克隆）。 以奶牛为例，产生相同遗传个体的方法有五种：①胚胎分割；②胚胎细胞；③胚胎干细胞；④胎儿成纤维细胞；⑤体细胞克隆等。 8.2.1 胚胎分割法---“多胚胎复制”的原理与方法 定义：着床的早期胚胎经显微手术后，分割为二、四、六等多等份，给每个受体子宫内移植一块分割物而妊娠产仔，这样由一个胚胎产生出多个遗传性能完全一样的后代个体。 严格讲，这种胚胎克隆只能算“多胚胎复制”。随着分割次数增加，发育成完整个体的能力越差。 (1)基本原理 软体动物和部分昆虫为镶嵌发育类型:从胚胎发育的2细胞起，每个分裂球将要发育成什么样的器官组织，在受精以后就已规定下来。去掉任何一个分裂球，就不能发育成为一个完整胚胎。 研究表明，哺乳动物从早期分裂阶段到原肠胚胚胎都能够复制。此后，胚胎的发育能力会随着胚胎所达到的发育阶段而改变。 如：分割胚的胚细胞只负责构成胚盘，胚盘的正常发育需要滋养层细胞。所以,在分割胚时应包括应滋养层细胞，否则不足以引起妊娠产仔。 （1）卵裂球分离培养法 用吸管固定胚胎，用玻璃针自上而下切开透明带使其形成一个切口，用微吸管自切口处伸入透明带吸住半数卵裂球，等分胚胎为两部分。 将分得的半胚装入空透明带中，置于血清中使其中充满血清。 琼脂包埋后，移入受体输卵管。 培养3～5d,发育到桑葚胚或囊胚时回收琼脂筒； 去掉琼脂，选择发育好的胚胎进行移植，产仔。 (2)桑葚胚及其以后阶段的直接分割法 这一阶段的胚胎分割时，可用固定吸管固定胚胎或不进行固定而直接分割。 囊胚阶段前的胚胎，要对透明带作软化处理。否则，由于透明带的韧性，在分割时一部分卵裂球会受到机械损伤。 之后，将胚胎连同少量分割操作液置于分割皿上，用显微玻璃针、显微刀片分割或徒手分割。 8.2.2 细胞核移植技术 细胞核移植（nuclear transfer）技术是目前最常用的、科技成分含量高的动物克隆技术，是动物克隆技术的核心。 细胞核移植技术：是利用显微操作仪，将外源细胞的核移植入去核卵母细胞中，经人工活化和体外培养后再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体。 (1)原理 胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中，可因其