【基础医学】分子寄生虫学第二讲.ppt

分子寄生虫学 第二讲 传病媒介的分子生物学 传病媒介主要是指那些可以传播疾病的无脊椎动物，其中绝大多数是节肢动物，如蜱、螨、蚊、蝇和白蛉等 分子鉴别：传播媒介的正确鉴别是该领域最基础的研究内容，传统的鉴别方法在遇到形态相似的近缘种时常会遇到混淆和出现错误，运用分子特征鉴别即可解决上述难题提供帮助。常用的分子特征是核糖体DNA和线粒体DNA的一些片段，如ITS，IGS（基因间隔区）28S编码区的第三结构域，线粒体DNA的细胞色素氧化酶亚单位1和亚单位2（CO1,CO2），细胞色素b（cytb）等。 在分类鉴别研究的漫长历程中，在不同时期和阶段研究者运用不同的方法或依据不同类型的特征对同一类群命名了许多“型”，如形态型、生态型、染色体型、同工酶型以及分子型等，这些型是分类研究中的过渡阶段，进一步明确其分类地位并使其相互统一，建立标准的鉴别方法是今后研究的重点内容之一。 传病媒介的分子生物学 转基因 WHO于20世纪90年代提出基因操作（gene manipulation）控制蚊虫的新策略，即通过转基因手段，把蚊虫抵抗疟原虫感染的相关基因转入蚊基因组，使其稳定遗传并在自然种群中驱动扩散，从而减少甚至阻断蚊虫的传疟效能 02年10月冈比亚按蚊基因组发布 目前蚊虫免疫和防御的分子机制研究主要集中在冈比亚按蚊和埃及伊蚊，发现多个基因在受到疟原虫攻击后，mRNA转录量发生改变，如抗菌肽防御素、革兰氏阴性菌结合相关蛋白、几丁结合相关蛋白、丝氨酸蛋白酶相关蛋白、半乳糖凝集素相关蛋白和氮氧化物合成酶等 传病媒介的分子生物学 转基因 难以估计参与蚊虫免疫应答的基因数量，但预计十分庞大 2002年另一突破性进展是转基因斯氏按蚊在实验室培育成功，研究人员将一种与蚊中肠上皮有很强亲和力的抗疟肽基因与羧基肽酶激活物和信号肽相连接转入蚊虫。转基因蚊在吸食感染性血后，疟原虫卵囊的数量与普通蚊相比约80％被抑制，并观察到疟原虫没有从转基因蚊传播到小鼠中。 传病媒介的分子生物学 群体 群体遗传结构研究是探讨种内不同群体遗传表型多样性及群体动力学的基础，其结果可为虫媒病的流行规律提供预测预报信息，并为转基因虫媒在自然群体中的驱动扩散提供重要的基础 同工酶指标常低估群体中变异的量 RFLP、RAPD、微卫星DNA以及序列标志等 RAPD-PCR和RFLP技术对埃及伊蚊和白纹伊蚊种内群体的判别方法进行探讨。中华按蚊群体显示具有较高的遗传多态性 遗传变异主要存在于群体内部，各地中华按蚊群体的遗传结构基本相同，没有明显分化。 传病媒介的分子生物学 群体 微卫星或单一序列重复单元是迄今调查从昆虫至哺乳动物各种生物群体结构及其动力学最好的分子指标 冈比亚按蚊的群体遗传结构与同域分布的近缘种阿拉伯按蚊自然群体间基因流水平较低，不同生态型群体和染色体型群体间具有广泛的基因流 基因流水平的高低与染色体倒位频率相关联，也与微卫星位点的选择有关。 群体与个体的差异比原先估计的要大的多，提示蚊虫群体遗传结构在多方面的复杂性，如习性、抗性及易感性等，增加媒介控制策略的难度 系统发育，抗性基因是研究热点 抗药性的扩散规律与群体遗传结构也有密切关系 分子寄生虫学的常用技术 基因克隆技术：又称之基因工程，是20世纪70年代末在多种交叉学科发展的基础其 上建立起来的重要分子生物学技术。其含义为在体外将核酸分子插入到病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之进入到原来不含这类分子的宿主细胞内持续稳定地存在，从而实现特定的功能表达：目的基因的获得与纯化；重组DNA分子的克隆与扩增；表达载体的构建与目的基因的表达 目的基因的获得：PCR技术扩增，从基因组获得的基因，原核生物可直接用于基因工程表达，而真核生物基因则需要重新拼接去除内含子后才可用于基因工程表达；基因人工合成，基因的人工化学合成具有快速、有效、灵活的优点，尤其对于设置某种生物偏爱密码子以利于在该生物中高效表达、插入或消除基因内部特定限制性内切酶位点，获得天然基因的衍生物等方面具有无可比拟的优势；基因组文库或cDNA文库筛选：基因文库是将某生物的基因组DNA通过工具酶切割成不同的片段，分别克隆入载体，得到的克隆群体即构成基因文库。利用合适的探针杂交，可从中筛选含有靶基因的克隆；cDNA文库是以mRNA为模板，反转录形成互补cDNA，再与载体连接、包装后形成。从中可筛选得到真核生物含polyA尾的mDNA基因，不含polyA尾的真核mRNA与原核生物mRNA,则不能从cDNA文库中得到 分子寄生虫学的常用技术 重组载体的克隆和转化：获得的线状DNA片段不具备自主复制功能，需要把基因片段连接到具备自主复制功能的DNA载体上，重组后引入宿主细胞中才能复制、扩增、繁殖。构建和选择适合于克隆的载体是基因工程技术的关键。选择载体时，需要考虑载体可