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胃癌、癌旁和正常组织端粒长度的变化 研究生 刘继昌 导 师 张宪法 河北大学基础医学院 前 言 本课题旨在检测胃癌、癌旁和正常胃 黏膜组织平均端粒长度的变化，并探讨胃癌平均端粒长度变化与临床病理指标的关系，为阐明胃癌发生、发展的机制提供一定的理论依据。 材料和方法 实验材料 标本 主要试剂 主要仪器 标 本 实验流程 探针制备 探针随机引物标记 探针灵敏度检测 （1）将模板DNA稀释成1000pg／μl， 100pg／μl，10pg ／μl，1pg／μl，100℃，15min，迅速移至－20?c冰 乙醇中。 （2）将NCM（硝酸纤维素膜）用20×SSC浸透后凉干。 （3）取1μl各稀释度样本点至各圆形NCM中心，80℃， 2h。 （4）预杂交：将烘干的NCM放入多孔加样板的孔洞中， 每孔加入20μl预杂交液，封孔后，42℃，3h。 （5）杂交：吸出预杂交液，加入1μl标记DNA混合于 100μl杂交液的液体20μl，封孔后，42℃，24h。 探针灵敏度检测 （6） 用冲洗液洗膜2次，并吸弃。 （7） 封闭液封闭，室温，1h。 （8） 加入封闭液稀释的Anti－Dig－AP （l： 2500），37℃，1h。 （9） 冲洗液冲洗3×15min，室温。 （10）显色缓冲液平衡2min，室温。 （11）加入显色缓冲液稀释的BCIP／NBT （1：50），室温，避光显色，数分后， 信号出现。 （12）加入TE液中止反应。 Southern印迹杂交 1. 凝胶电泳 上样量：已酶切后的DNA3ug 。 1×TBE电泳缓冲液，恒压60V，电泳2～4h。 2. 转膜 变性、中和处理 Southern转印 DNA固定 3. 杂交 （1）将尼龙膜漂浮于一盘2×SSC的液面上，待其由下至上完全 湿 润，将膜侵入液体内泡2分钟。 （2）湿润尼龙膜放入杂交袋中，灌注预杂交液，封口机封口， 42℃预杂交4－12个小时。 （3）按100cm2膜加入3.5ml杂交液的量将适量探针加入杂交液 中，浓度为100ng/ml。 Southern印迹杂交 （4）42℃，杂交16－20个小时。 （5）杂交结束后，倒出杂交液，用洗膜Ⅰ液洗，2分钟×3次。 （6）倒出洗膜1液，换加洗膜Ⅱ液于58℃水浴中洗膜两次，5分 钟×2次。 （7）杂交膜在冲洗液中平衡1min。 （8）按100ml/100cm2的量于封闭液中室温缓慢摇动1小时。 （9）按20ml/100cm2膜的比例用封闭液1：2500稀释Anti-Dig-Ap 加入稀释的抗体混合物，37℃反应1个小时。 （10）倒掉抗体液，将膜取出，放入玻璃盘内，按100ml/100cm2 的量用冲洗液洗膜，室温下15min×2次。 4. 免疫显色 平均端粒长度的计算 统计软件为SPSS10.0 结 果 一. 杂交前标本制备结果 基因组DNA凝胶电泳鉴定结果 基因组DNA酶切电泳结果 二. 探针制备结果 探针灵敏度检测结果 探针最适工作浓度的检测结果 光密度扫描结果 四. 统计分析结果 讨 论 一. 端粒长度的测定 结 论 正常胃黏膜组织端粒长度与供体年龄负相关。 按正常胃黏膜-癌旁-胃癌的顺序端粒长度明显缩短。 胃癌端粒长度缩短与临床病理指标无显著相关性。 端 粒 P值 P＜0．05 P＞0. 05 P ＞0. 05 年龄组 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 3 7 10 4 8 10.767±0.252 7.471±0.214 6.780±0.235 6.275±0.457 4.725±0.656 9.533±0.643 6.900±0.252 5.980±0.308 5.650±0.311 3.936±0.940 8.476±0.503 6.229±0.263 5.010±0.538 4.825±0.624 3.050±1.149 正常 癌旁 癌组织 TR