磁性纳米颗粒定向固定化脂肪酶及其应用分析-immobilization of lipase by magnetic nanoparticles and analysis of its application.docx

独创性声明本人声明所呈交的学 位论文是我个 人在导师指导下 进行的研究工 作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰 写过的研究成果 。对本文的研究 做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□， 在 年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打―√‖）学位论文作者签名： 指导教师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文II摘 要磁性纳米颗粒具有比表面积大、可均匀分散于反应体系、表面易修饰为各种不 同活性基团等优点，以其为载体固定化的酶在反应体系中几乎不存在传质阻力，且 能够非常容易地在外加磁场作用下分离回收以重复使用，从而大大降低酶的使用成 本。其中磁性纳米颗粒共价交联固定化酶稳定性最佳。但传统的共价固定化载体多 随机与酶分子上的活性基团共价交联，这可能导致底物进入酶活性位点的通道被阻 塞，或形成多位点结合，更甚者，当共价结合位点在酶催化活性中心附近时，会造 成酶活性构象发生不可逆的改变，导致酶活大幅降低。为此，本文通过生物信息学 分析获知酶的结构信息，以此为基础，开发简便易行的定向固定化方法。针对不同 酶种采用不同固定化体系，并首次使用反胶束固定化体系，获得了高催化性能的固 定化酶。同时也为其它酶种的定向固定化提供有益借鉴。本文以自制 Fe3O4 磁性纳米颗粒（MNPs）为载体，定向固定化解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶 LIP2 (YLLIP2)和洋葱伯克霍尔德菌（ Burkholderia cepacia）脂肪酶（BCL），并进行了应用探索，主要研究内容及结果摘要如下：1. 通过化学共沉淀法了制备了 MNPs，并以（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES） 包覆其表面，得到带-NH2 功能化的 A-MNPs。采用 XRD 和 FT-IR 对其进行表征， XRD 图谱证实所得磁性纳米颗粒为 Fe3O4 MNPs，且 Fe3O4 晶相呈现出反尖晶石型，不含其它杂相，说明制备的磁性纳米晶纯度极高。FT-IR 检测结果表明，APTES 成 功实现了对 MNPs 的包覆。所制备的磁性纳米颗粒 MNPs、A-MNPs 粒径分别为 17.2 nm 和 18.4 nm。2. 通过分析 YLLIP2 和 BCL 一级结构，获知了两种酶蛋白的氨基酸组成及带不同活性基团的氨基酸残基含量。运用 Rasmol 软件进一步分析了两种酶的三维构象， 研究酶蛋白中的游离 ε-NH2、-COOH、-OH、-SH 在其分子上的分布。结果显示，两种酶的游离 ε-NH2 在酶分子上呈现区域化分布，距离酶的催化活性中心均较远，而 其它活性基团则相对均一地分布在酶分子上。为此，选择游离氨基作为共价固定结合点，以定向固定化 YLLIP2 和 BCL。在此基础上，结合固定化载体性质，拟定了IIII分别通过酶蛋白上的游离 ε-NH2 和-COOH 为共价结合点的两种不同固定化策略，实现酶的固定化。结果表明：YLLIP2 通过酶上游离氨基和羧基固定化，固定化酶蛋白 比活力分别为游离酶的 36.9%、17.3%；而 BCL 通过酶上游离氨基和羧基固定化，固定化酶蛋白比活力分别为游离酶的 128.2%和 94.6%。验证了生物信息学分析的结论。3. 确定以游离氨基为共价固定结合点后，以醛基活化的 A-MNPs （G-MNPs） 为载体，在水相中共价固定化 YLLIP2 和 BCL，并对其固定化条件进行了单因素优 化。结果表明，两种酶在水相固定化体系中，固定化率均较高，可达 85%以上。在 最优条件下，水相固定化 YLLIP2 的水解酶活回收率为 42.4%；而 BCL 在固定化体 系中存在甘油酯作为激活剂和保护剂的条件下，固定化酶活力得到大幅度提高，其 酯化酶活回收率高达 1081.9%。4. 以 G-MNPs 为固定化载体，首次在反胶束固定化体系中实现了对 YLLIP2 和 BCL 的定向共价固定化。YLLIP2 在 Span 20 反胶束体系中定向固定化后，水解酶活 回收率可达 540.2%。优化条件为表面活性剂 Span 20，W0=1.12，正己醇为助表面活 性剂且 Z=2.26 时，酶活回收率进一步提高到 1466.