[医学]生化仪器分析-09-5SDS-PAGE5.ppt

§9-5 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sul-phate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS- PAGE），简称SDS电泳，它是根据SDS和还原剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定PH（碱性）缓冲系统的分离。主要用于测定蛋白质亚基分子量。与光散射、渗透压、超速离心（蔗糖密度梯度离心，沉降平衡技术）及层析方法（凝胶过滤）相比，它不需要昂贵的仪器设备，操作简便，能在几小时内得到结果，有较高的重复性，且不需要非常纯的样品（取决于样品的组成和对结果的要求），是目前为大家所接受的用于测定亚基分子量的一种最好的方法。这个方法可用于多肽分子量的分析，用于变性蛋白的分离以及仅仅溶解在离子去污剂中的膜蛋白和用层析方法分离的蛋白和酶的纯化控制。 第一节 原理 1．蛋白质分子的解聚 蛋白质样品在100℃用SDS和还原剂处理3-5mins后解聚成亚基 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，在100℃保温3-5分钟，分子被解聚为组成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个： ⑴溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在的，能与蛋白质结合的是单体。单体的浓度与SDS总浓度，温度和离子强度有关。当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4。如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1:0.4。这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3。 胶束在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系 ⑵样品缓冲液的离子强度 因为SDS结合到蛋白质分子上的量仅决定于平衡时SDS的单体浓度，不是总浓度，而只是在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。所以SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10～100mmol/L。 ⑶二硫键是否完全被还原 只有二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量的结合到亚基上而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。样品缓冲液中的β-巯基乙醇的浓度通常为4％-5％，二硫苏糖醇的浓度通常为2％-3％.前者有挥发性，所以最好在配置样品前加入。 2.缓冲系统的选择 由于SDS对蛋白质的溶解性能以及负电荷的包 裹作用，所以在选择SDS电泳缓冲系统时要比常规 聚丙烯酰胺凝胶电泳简单的多。一般来说，在被 分析的蛋白质稳定的PH范围，凡不与SDS发生相互 作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋 白质带的分离和电泳的速度是非常关键的。 3.凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密 度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大 小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。不同分 子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 凝胶浓度与分子质量测定的关系 凝胶浓度T （C=2.6％） 分子质量范围 （kDa） 凝胶浓度T （C=5％） 分子质量范围 （kDa） 5 10 15 20 25-200 10-70 ＜ 50 ＜40 5 10 15 20 60-170 20-100 10- 50 5 - 40 对于具有不同迁移率的多组分样品，很难选择一种浓度的凝胶来分离，此时最好使用梯度胶，使感兴趣的组分正好走在凝胶的中间位置。梯度胶浓度范围的选择主要根据样品的特性：样品的分子质量范围，样品组分电泳带的相对位置，感兴趣组分的分子质量等。根据这些因子的选择梯度形式（线性梯度或指数梯度）和浓度梯度范围，充分利用分子筛效应提高分辨率。实际上，凝胶浓度低于3％或高于25％都不能被使用。 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳 迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合如下方程 式： Lg MW =－b 