细胞生物学实验的讲义.docVIP

细胞生物学实验讲义 宋林霞 王学 庞秋香 徐振彪 丁忠峰 编写 山东理工大学生命科学学院 2009．3 前言 细胞生物学在整个生物学科体系中可以说占据一个十分特殊的地位：它既是基础又是前沿。作为基础，19世纪细胞学说的建立被认为是现代生物学的三大基石之一，所以细胞生物学可以作为继动物学、植物学之后最基础的专业课程。但同时细胞生物学又是相对比较前沿的学科，最近二十年中生物学的最新进展主要是体现在细胞生物学方面。 细胞生物学的这种特殊的地位使得本科实验课程的开设面临一个比较尴尬的局面：作为主要的基础课程，我们有必要了解其常用的研究方法；但另一方面，这些实验方法基本上都需要十分昂贵的仪器和耗材，操作时间长，操作难度大，在本科实验课程体系中开设具有很大的困难。所以至今为止，细胞生物学还没有一套类似于动植物学的与理论课相适应的实验课体系。 尽管如此，实验课中安排的实验项目仍然具有很大的意义。也许我们在实验课中应当学到的主要知识并不是掌握具体的实验方法，而是养成良好的实验习惯。其中包括：善于思考，保持实验操作的有条不紊并尽量有效缩短时间，学会与其他人相处等等。这些良好实验习惯的养成对于我们日后的生活和工作都有非常大的帮助。即使是一些小的细节，如在实验后收拾好器材等，也是对我们有帮助的值得注意的习惯。所以，我们在对待每一个实验项目上都应该保持一种认真的态度，这也是在生活中对待其他事情的良好习惯。 本实验教程分两部分：上篇介绍细胞生物学的主要研究方法，下篇列出实验课上须要进行的实验项目。由于一些同学经常反映在理论课学习时细胞生物学研究方法部分比较难于理解，因此在此教程的上篇部分，参考一些细胞生物学理论教材对细胞生物学的常用研究方法的原理和用途做一个总结，作为理论课教学的补充，希望能对细胞生物学的学习和日后的考研有一点帮助。实验项目部分所列的项目都是以前实验课上做过的常规实验，教程上所写的注意要点或实验体会都是在以往实验的基础上总结出来的，当然，实验操作不是一成不变的，同学们可以在实验的过程中自己体会，适当摸索以获得好的实验结果。目录 上篇 细胞生物学研究方法概述 1 第一章 显微成像技术 1 一．光学显微镜 1 1．光学显微镜的分辨率 1 2．普通光学显微镜 2 3．荧光显微镜 3 4．相差显微镜 4 5．暗视场显微镜 5 6．倒置显微镜 5 7．激光共焦点扫描显微镜 5 二．电子显微镜 6 1．透射电子显微镜 6 2．扫描电子显微镜 9 三．扫描隧道显微镜 9 第二章 细胞化学技术 10 1．显示DNA和多糖 10 2．酶细胞化学技术 10 3．免疫细胞化学技术 11 4．原位杂交技术 11 5．显微放射自显影技术 12 第三章 流式细胞术 12 第四章 细胞工程技术 13 1．细胞培养 13 2．细胞融合 14 3．细胞拆合和显微操作技术 15 下篇 细胞生物学实验项目 16 实验一 特殊显微镜的原理和使用 16 实验二 液泡系和线粒体的活体染色 16 实验三 动物骨髓细胞染色体标本的制备 17 实验四 Feulgen反应 19 实验五 细胞融合 21 实验六 细胞膜的通透性 22 实验七 叶绿体的分离和荧光观察 24 实验八 植物细胞骨架的光学显微镜观察 25 上篇 细胞生物学研究方法概述 第一章 显微成像技术 在利用显微镜时首先需要掌握的概念是分辨率（r），即所能分辨的两点之间的最小距离。所以，r值越小，分辨率越高，分辨能力就越强。我们人眼睛的分辨率大约是0.2mm，这主要是由视网膜中的感光细胞的大小来决定的。物体中相近两点的影像只有投影在不同的感光细胞时才能被分辨（图1.1）。任何显微镜都有一定的分辨率的极限，如光学显微镜的分辨率通常为0.2μm，不可能将物体无限放大。 一．光学显微镜 1．光学显微镜的分辨率 光学显微镜的分辨率通常为0.2μm，这主要是由可见光的波长来决定的。根据显微镜分辨率（r）的公式： r=0.61λ/nsinα λ：照明光源的波长； n：聚光镜和物镜之间介质的折射率； α：样品对物镜孔径角的半角 λ的最小值为400nm（紫色可见光），sinα的最大值为1，如果用空气作为聚光镜和物镜之间的介质（折射率为1），其分辨率大约为0.3μm；如果用油镜作为介质（折射率为1.5），其分辨率大约为0.2μm。所以参考人眼0.2mm的分辨率，光学显微镜的的最大放大倍数为1000倍，油镜的主要作用是提高分辨率。因此，目前市面上所有显微镜的最大放大倍数都是1000倍（油镜100倍，目镜10倍），即使再提高放大倍数都不能使我们更看清样本，只是“空放大”。而且，0.2μm只是一个理想值，一般显微镜由于做工问题都不能达到这个值，一般说来，价格越高的显微镜分辨率越接近0.2μm。另外，如果想提高分辨率，可以用λ更小的紫外光作