蛋白质的分离纯化及鉴定技术生化分析ppt课件.pptVIP

第八章 蛋白质的分离纯化及鉴定技术 蛋白质相对分子质量常用研究方法： 1.根据化学组成测定最低相对分子质量 2.渗透压法测定相对分子质量 3.沉降分析法（离心） 4.凝胶过滤法测定相对分子质量 5.聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 1. 根据化学组成测定最低相对分子质量 用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，推导出蛋白质最低相对分子量。 例如，肌红蛋白含铁量为0.335％，其最低相对分子质量可按下式算出： 注意：最低相对分子量 =（55.8/0.335）X100=16700 2. 渗透压法测定相对分子质量 （1）渗透(osmosis):溶剂分子由纯溶剂(或稀溶液)向溶液(或浓溶液)单方向的净移动现象. （2）理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用范托夫公式表示： π= cRT／Mr π渗透压(单位为Pa)；c溶质的浓度 ；T绝对温度(K)；R气体常数；Mr溶质的分子质量 3. 沉降分析法（离心） 利用超速离心测定蛋白质的相对分子质量，沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。 当分子以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力处于平衡状态时，根据斯维得贝格方程： Mr = RTS / D(1-νρ) T是绝对温度(K)；R是气体常数；S为沉降系数（单位离心场的沉降速度，用10-13秒作为一个单位）；D为蛋白质的扩散系数；ρ为溶剂密度；ν为蛋白质的偏微比容（约为0.74cm3/g），通过测得蛋白质的s值和D值，就可以算出蛋白质的相对分子质量。 电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系： log Mr = a—bμR 式中Mr为相对分子质量，a、b都是常数，μR是相对迁移率： μR = 样品迁移距离/前沿（染料）迁移距离 实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其μR值作图，根据待测样品的μR,从标准曲线上查出它的Mr。 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度或比活，以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性(比活常以活力单位数／毫克蛋白质表示)。 分离纯化某一特定蛋白质的一般程序： 前处理 粗分级分离 细分级分离 蛋白质分离纯化的一般原则 1. 前处理 (pretreatment) 分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。 （1）预处理： 动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织， 种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。 （2）破碎：然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。 植物组织和细胞，由于具有细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎，液氮破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌细胞的破碎的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理(分解肽聚糖)等。 （3）提取：组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开。 如果所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。 2 粗分级分离 (rough fractionation) 目的：当蛋白质提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。 这一步的分级分离一般用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓缩。 3 细分级分离 (fine fractionation) 进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。 还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。 用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 4 结晶 结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。 由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的。 一、蛋白质含量测定 两类方法 利用蛋白质的物理性质，如折射率、比重、紫外吸收等 利用化学方法测定蛋白质含量，如：微量凯氏定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂法 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 1. 凯氏