海洋微藻共栖细菌抑藻活性及群体感应相关基因的初步分析-preliminary analysis of algae - inhibiting activity and quorum sensing related genes of marine microalgae symbiotic bacteria.docxVIP

摘要摘要II海洋微藻共栖细菌抑藻活性及群体感应相关基因的初步研究摘 要藻菌的相互作用是海洋生物群落种间关系的研究热点，在微藻的生消与群落 演替中占有重要地位。已有研究表明微藻的共栖细菌可以抑制藻类的生长，甚至 裂解藻细胞，从而表现出溶藻效应，这类溶藻细菌对维持藻类生物量平衡具有非 常重要的作用，而探明溶藻细菌的作用机制是研究藻菌相互作用的关键。本文针 对微藻共栖细菌的溶藻活性具有密度依赖性的特点，创新性的提出微藻共栖细菌 代谢溶藻物质受到群体感应（Quorum Sensing，QS）系统调控的设想，并在本文 中进行了初步验证。本文从 61 株海洋微藻中共分离出 206 株共栖细菌，利用 Agrobacterium tumefaciens A136 （pCF218/pCF372）生物传感器的检测方法筛选出 11 株细菌具 有基于 AHLs 的 群 体 感 应 系 统 ， 它 们 分 属 于 3 类 海 洋 细 菌 的 系 统 分 支 ： α-proteobacteria，γ-proteobacteria 和 Gram+细菌，通过 GC-MS 检测，确定 11 株 共栖细菌都含有 C8-HSL，部分含有 C6-HSL 和 C14-HSL，其中 9 株细菌具有抑 藻活性，分别对东海原甲藻、棕囊藻、海链藻和赤潮异湾藻具有不同程度的抑制 作用。利用生物自显影方法建立了抑藻化合物跟踪筛选模型，该模型中以四爿藻（Tetraselmis）作为目标抑藻藻株，培养终浓度为 105cell/mL，在固体培养基上 进行光照培养 6 天。以筛选到的一株抑藻细菌 Ponticoccus sp. PD-2 为研究对象， 规模化培养后，对其代谢产物进行分离纯化。基于所建立的抑藻化合物筛选模型， 利用 TLC 制备和 HPLC 检测的方法，最终获得一个抑藻化合物。通过 LC-MS 分 析，该抑藻化合物的分子量为 278.1643，初步判定其分子式中含有一个苯环。本 文建立了抑藻化合物 HPLC 分析方法，对 PD-2 不同生长时期的代谢情况进行了 跟踪检测，发现 PD-2 抑藻活性物质的产生具有密度依赖性，即细菌 PD-2 产生 的抑藻活性物质受到群体感应的调控。通过 Illumina 测序技术对细菌 PD-2 进行全基因组测序，获得基因组大小约 为 4.915Mb 的 PD-2 全基因组序列，通过对 PD-2 的测序数据利用 Glimmer 软件海洋微藻共栖细菌抑藻活性及群体感应相关基因的初步研究海洋微藻共栖细菌抑藻活性及群体感应相关基因的初步研究IIII进 行 编 码 基 因预 测 ，并 将 预 测 得 到的 基 因序 列 与 COG 、 KEGG 、 GO 、InterproScan、nr 功能数据库做 Blast 比对，进行基因功能注释分析，最终在细菌 PD-2 中获得了群体感应信号分子 AHLs 合成酶基因 LuxI 和转录调节蛋白 LuxR 同 源 基因 片 段， 从 而从 分 子水 平 上初 步 证实 了 细菌 PD-2 中确实 存 在类 似 LuxI/LuxR 调控的群体感应系统。本项研究为微藻共栖细菌的抑藻活性受到群体感应的调控提供了理论基础， 并进一步加深了对细菌群体感应调控功能的认识，同时也为赤潮防治提供了新思 路。关键词：微藻共栖细菌，群体感应，抑藻活性，全基因组，luxI/R 基因AbAbatract PAGE PAGE VIAbstractThe interaction of bacteria and alga is the research hotspot of marine biological communities interspecific relationship. It occupied an important position in the microalgae elimination and community succession. Some research showed that microalgicidal bacteria inhibited the growth of algae, even cracked algal cells to show the dissolve algae effect. This kind of algicidal bacteria plays a very important role in balancing the algae biomass. And proven the mechanism of action of algicidal bacteria is the key to research the interaction of bacteria