海洋细菌catenovulum sp.x3新型α-淀粉酶hp665和β-琼胶酶baq基因克隆 表达及酶学性质研究-cloning, expression and enzymatic properties of a novel α -amylase hp 665 and β -agarase baq gene from marine bacteria catenovulum sp.x3.docxVIP

汕头大学硕士毕业论文汕头大学硕士毕业论文万方数据万方数据摘要海洋微生物是海洋生物资源的重要组成部分，其分布非常广泛，且在地球几 亿年进化过程中为适应海洋特殊环境，产生了多样性酶资源。海藻多糖降解酶是 海洋生物酶的一个重要的分支，多样性丰富，在工业生产和生物质能源开发利用 中具有重要的价值。本论文主要研究来源海洋细菌 Catenovulum sp.X3 的新型淀 粉酶和琼胶酶，对其进行基因克隆、高效表达以及酶学性质分析，主要研究结果 如下：通过对琼脂、β-环糊精诱导 Catenovulum sp.X3 的胞外蛋白进行酶活力测定 和活性染色分析，结果显示菌株 X3 具有琼胶酶和淀粉酶活性，可能含有多个降 解琼脂和淀粉的酶。将具有降解琼脂的蛋白条带进行质谱鉴定，其中 N1 与 hypothetical protein（gi|515524375|）的部分肽段匹配，预测为 GH13 家族的 α-淀 粉酶；B2 与 β-agarase C（gi|584426719|）的部分肽段匹配，预测为 GH16 家族的 β-琼胶酶。根据 N1 和 B2 蛋白质谱鉴定结果，从菌株 X3 中克隆得到一个淀粉酶 基因 HP665 和一个琼胶酶基因 Baq。HP665 与已报导的淀粉酶序列最大相似性 为 49%；Baq 与已报导的琼胶酶 HYPERLINK /protein/545599236?report=genbankamp;log%24=protalignamp;blast_rank=7amp;RID=K429RYG7016 gb|AGW43026.1|序列相似性为 61%。通过构建 重组表达体系 BL21-pET32(+)-HP665 和 BL21-pET32a(+)-Baq，分别实现了重组 蛋白可溶性表达。通过硫酸铵盐析和镍柱亲和层析从重组菌发酵液中分离纯化得到重组酶 HP665，具有淀粉酶活性。以可溶性淀粉为底物，研究 HP665 的酶学性质，发现 其最适反应温度为 30-35 ℃，最适反应 pH 为 9.0，pH 6.0-10.0 保留 70%以上的 相对酶活力；除 Mg2+外，大部分金属离子抑制其淀粉酶活性；表面活性剂 Triton X-100、Tween-80 和尿素对其酶活性影响不大，EDTA 抑制作用明显；HP665 能 在 0.5-4.5 mol/L NaCl 作用下保持较高活性；低极性的有机试剂苯和正己烷能将 酶活力提高 35-50%；HP665 降解可溶性淀粉和马铃薯淀粉的产物相同，均为麦 芽糖以上的寡糖。结果表明 HP665 是一个耐盐、耐有机试剂的嗜冷型碱性 α-淀 粉酶。淀粉酶 HP665 主要包括 4 个结构域，信号肽、淀粉酶催化域（Aamy）、淀 粉酶催化 C 域（Aamy-C）和碳水化合物绑定模块（CBM20）。通过构建 C 末端I截短突变体，发现 HP665 维持对淀粉的催化作用依赖于 Aamy-C 结构域的完整性，CBM20 不影响 HP665 与底物的的识别和作用方式。此外，CBM20 缺失突 变体 C566 的最适反应温度、pH、底物特异性、降解可溶性淀粉和马铃薯淀粉的 产物均与野生型一致，但是在高温、强碱性条件下，酶稳定性明显下降。本文还对琼胶酶 Baq 进行了研究，Baq 含有 GH16 家族琼胶酶完整的保守区， 构建的重组表达体系 BL21-pET32a(+)-Baq 诱导后具有琼胶酶活性。通过亲和层 析从菌体中分离纯化得到重组琼胶酶 Baq。对重组琼胶酶 Baq 酶学性质进行研究， 发现 Baq 降解琼脂糖的最适反应温度和 pH 分别为 50 ℃和 8.0；50 ℃孵育 30 min， 仍保留 65%以上的残余酶活力；Baq 降解琼脂糖的终产物是新琼二糖和四糖。结 果表明 Baq 是一个能耐较高温度的 β-琼胶酶，热稳定性较好。 关键词：Catenovulum sp.X3；α-淀粉酶 HP665；β-琼胶酶 BaqIIAbstractMarine microorganism is an important part of biological resources, which is widely distributed in marine. In addition, the microorganism has produced various kinds of enzyme in the process of billions of years of evolution in order to adapt the complicated marine environment. Seaweed polysaccharides degradation enzyme with abundant diver