基因转移及方法1126.ppt

1、在下述双链DNA序列（仅列出其中一条链序列）中不属于完全回文结构的是： AGAATTCT TGAATTCA GGAATTCC CGTTAAGC AGATATCT 2、可识别并切割特异DNA序列的称 限制性核酸外切酶 限制性核酸内切酶 非限制性核酸外切酶 非限制性核酸内切酶 DNA酶 3、在重组DNA技术领域所说的分子克隆是指 建立单克隆抗体 建立多克隆抗体 构建重组DNA分子 无性繁殖DNA 有性繁殖DNA 4、在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的是DNA 聚合酶 解链酶 连接酶 拓扑酶 内切酶 5、在已知序列的情况下获得目的DNA最常用的方法是： 化学合成法 筛选基因组文库 筛选cDNA文库 聚合酶链式反应 DNA合成仪合成 6、某限制性内切酶切割5’-…GGGGG▼AATTCC…-3’序列后产生： 5’突出末端 3’突出末端 5’及3’突出末端 5’或3’突出末端 平末端 7、重组DNA技术领域常用的质粒DNA是： 细菌染色体DNA的一部分 细菌染色体DNA外的独立遗传单位 病毒基因组DNA的一部分 真核细胞染色体DNA的一部分 真核细胞染色体DNA外的独立遗传单位 8、直接针对目的DNA进行筛选的方法是： 青霉素抗药性 氨苄青霉素抗药性 分子杂交 分子筛 电泳 9、不能用作克隆载体的是 质粒DNA 噬菌体DNA 细菌基因组DNA 腺病毒DNA 逆转录病毒DNA 10、克隆某一目的DNA的过程不包括： 基因载体的选择与建立 外源基因与载体的拼接 重组DNA分子导入受体细胞 筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞 表达目的基因编码的蛋白质 名词解释： plasmid； vector； restriction endonuclease； 回文结构 基因工程方案 ： 分 、切 、接 、转 、筛 一 、分：目的基因的分离：从染色体 DNA 中分离 ；人工合成 ；反转录 ；基因文库 二、切：限制性内切酶的应用：平端切口；粘端切口 三 、接：把载体和目的基因连接成重组体：DNA 连接酶；“ 尾接法”；“ 人工连接器” 四 、转：重组体的转化 五 、筛：DNA 重组体筛选与鉴定：表型 ，DNA 限制酶酶切图谱, 核酸杂交 , 表达产物鉴定等 。 分——目的基因的分离 目的基因的获得及方法 目的基因概念 获得目的基因方法 构建cDNA文库 构建基因组文库 人工合成目的基因 PCR合成 其他方法：差异显示，基因陷阱 目的基因的概念 基因是DNA分子上含特定遗传信息的核酸序列的总称，是遗传物质的最小功能单 位。 目的基因：对基因组中某个基因通过克隆扩增，获得该基因进行研究或应用称这种基因为目的基因。 目的基因的用途 研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、调控 寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与治疗 研究生物种系进化与相关同源性 基因工程重组表达 改造某些基因 基因治疗 原 理 原核目的基因获得：直接分离 真核目的基因获得： ( 一 ) 载体 ：宿主细胞内可独立复制的完整 DNA 分子 。 质粒 ( plasmid ) 噬菌体 M13 噬菌体 逆转录病毒 DNA 昆虫病毒 DNA（插入动物细胞 ） ( 二 ) 目的基因的来源 从cDNA 中分离 人工合成 反转录 基因文库 PCR 其他方法：差异显示，基因陷阱等 构建cDNA文库筛选目的基因 选材：mRNA丰富，目的基因表达活跃 注意点：防止RNA酶污染 构建流程 组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质 提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析 合成cDNA第一链 ↓反转录 合成cDNA第二链 ↓插入载体 重组DNA ↓导入大肠杆菌扩增 构建cDNA文库 mRNA的分离 10-5μg/细胞，80~85%为rRNA，15%小分子量RNA（tRNA等）1-5%mRNA，28S：18S=2：1 提取总RNA ：常规方法；Trizon 提取纯化mRNA：oligo-dT柱 反转录合成cDNA 合成cDNA第一链：反转录酶 合成cDNA第二链： 置换合成法：RNA酶H；DNA聚合酶Ⅰ； T4 DNA连接酶 外加引物合成法：全长双链 PCR 构建cDNA文库 cDNA两端加接头或衔接头 cDNA与载体相连 导入宿主细胞进行克隆 筛选目的基因 核酸杂交法：探针 免疫结合法：抗体 其他方法：双杂交；基因芯片 构建基因组文库筛选目的基因 要求：全 流程：组织细胞 ↓温和破碎细胞 DNA片段与载体的连接包装 ↓限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒