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支原检测试剂盒
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25个反应
PCR 10倍浓缩反应缓冲液 蓝色瓶盖
740 μl
阳性对照 DNA 绿色瓶盖
含有支原体基因组的DNA片段,
非传染性, 冻干
内控对照 DNA 黄色瓶盖
质粒DNA, 非传染性, 冻干
1.2 稳定性与保存
收到试剂盒后应2-8°C保存。重悬引物/核苷酸Mix及阳性对照和内控对照DNA后,应置于-18°C以下保存。避免反复冻融。如果每次进行检测的样本很少,应将以上三种试剂分装。
1.3 其他所需的试剂及仪器
PCR仪
矿物油(特殊反应)
PCR管
DNA电泳设备
离心机,加样器
去离子水,无DNA水
聚合酶
注意:使用Minerva Taq酶效果最好。也可以用其它厂家的Taq酶,但一定要用与酶相配的缓冲液,并调节Mg离子浓度到3mM。推荐使用的Taq酶表见网址:。
原理
该试剂盒应用的引物对支原体高度保存的rRNA操纵子(支原体基因组中16SrRNA的编码区序列),具有很高的特异性,可以检出含有1-5个支原体DNA片段及2-5个支原体的样本。而且,对于真核和细菌DNA不产生扩增效应。试剂盒中还提供内控对照,在DNA电泳上会显示191bp的条带,内控对照是PCR反应成功的标志。因此,只需一种方法就可以检测出几乎所有的支原体种类,而且,所有操作只需3小时即可完成。
3. 检测方法
3 .1 准备与样品原料
当细胞株中检测到的支原体2x103个/ml支原体的水平时,即使加入抗生素去除,也会由于耐药反应,使细胞株中的支原体继续存在。因此,检测前,应在不含抗生素的情况下,将待检测的细胞株进行培养,至少培养一代。样品应取自生长密度已达到90-100 %的细胞。在培养时间较长的培养基中,可能会发现有PCR抑制物的积聚。检测前,必须对样本进行DNA提取。为了避免出现假阳性结果,我们建议使用去离子的、无DNA水,带滤芯的tip头和手套。
PCR模板的准备:将细胞培养基上清液煮沸5分钟,或用其他生物方法准备模板。
操作步骤如下:
1. 从待检测的培养基中取出100 μl上清液加入到已消毒的离心管中。将瓶盖密封好,以防止加热时瓶盖打开。
2. 将样本的上清液加热,煮沸至95°C或温育5分钟。
3. 加入PCR混合物前,将样本的
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