甲基莲心碱对肝星状细胞Collagen—I,TIMP—1及MMP—2影响.docVIP

甲基莲心碱对肝星状细胞Collagen—I,TIMP—1及MMP—2影响 　　[摘要] 目的：观察甲基莲心碱对肝星状细胞Collagen-I，TIMP-1及MMP-2 mRNA表达及蛋白分泌的影响。方法：体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6，随机分为5组：对照组、血小板衍生因子（PDGF）组、甲基莲心碱低、中、高剂量组（2，6，10 μmol·L-1）。分别加入各组药物培养48 h后，收集细胞提取总RNA，采用RT-PCR检测Collagen-I，TIMP-1及MMP-2 mRNA表达，并收集细胞上清液采用ELISA检测3个因子的蛋白含量。结果：与对照组相比，PDGF可明显增加肝星状细胞Collagen-I，TMIP-1及MMP2 mRNA表达及蛋白分泌。与PDGF组相比，甲基莲心碱中、高剂量组Collagen-I及TMIP-1 mRNA表达及蛋白分泌明显减少，且随着浓度的增加，减少更明显，而甲基莲心碱低剂量组Collagen-I及TMIP-1 表达及分泌无明显变化。与PDGF组相比，甲基莲心碱3个剂量组的MMP-2 mRNA表达及蛋白分泌均无明显变化。结论：甲基莲心碱可抑制PDGF诱导的HSC的Collagen-I和TIMP-1的mRNA表达及蛋白分泌，且随浓度的增加，抑制作用加强，但对MMP-2的表达及分泌无明显影响。 　　[关键词] 肝星状细胞；甲基莲心碱；Collagen-I；TIMP-1；MMP-2 　　肝纤维化（liver fibrosis，LF）是指肝脏内弥漫性纤维结缔组织沉积，是肝脏对慢性炎症坏死或其他损伤的修复反应，它不是一个独立的疾病，也不是一个独立的诊断，而是许多慢性肝病发展的共同病理过程[1]。围绕肝纤维化发生、发展的各个环节，尤其是抑制肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活和增殖，已成为近10年肝纤维化治疗的研究热点。陆续有文章报道甲基莲心碱（neferine）的抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、化疗药增敏剂及抗肺纤维化等作用[2-3]，但其对肝纤维化的作用报道甚少，本课题组前期研究表明甲基莲心碱可以促进线粒体凋亡途径诱导HSC凋亡，从而发挥抗肝纤维化作用，甲基莲心碱6，10 μmol·L-1组有明显统计学差异[4]，本实验拟在前期研究基础上，着眼于细胞外基质的产生与降解，从基因及蛋白水平研究甲基莲心碱对肝星状细胞Collagen-I，TIMP-1及MMP-2表达的影响。进一步阐述其抗肝纤维化的机制，为其临床应用提供理论及实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂与仪器 大鼠肝星状细胞HSC-T6由美国加利福尼亚旧金山总医院肝病研究中心Frideman教授、第二军医大学张俊平教授、西安交通大学第一附属医院许君望教授惠赠，系SV40转染的大鼠肝星状细胞，具有活化HSC的表型；高糖DMEM培养基（Thermo公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程研究所）；甲基莲心碱（CHENGDU MUST Bio-technology）；血小板衍生因子（platelet-derived growth factor，PDGF，上海先锋公司）；DMSO（美国Sigma公司）；marker和琼脂糖（Promega公司）；2×Taq Master Mix（康为世纪）；引物合成（北京奥科鼎盛生物技术公司）；RNA提取试剂盒fastgen 200（上海飞捷生物技术有限公司）；逆转录试剂盒（TaKaRa）；ELISA 试剂盒（北京科盈美科技有限公司）；CO2恒温箱（Thermo公司）；超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司）；RT-PCR仪（AB Applied Biosystems）；电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；凝胶成像分析系统（培清科技）。 　　1.2 细胞培养 HSC-T6细胞于含10%FBS的DMEM培养基中，置于37 ℃，含5% CO2饱和湿度培养箱中培养，2～3 d后0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验，甲基莲心碱用DMSO溶解。实验分为5组，即对照组、PDGF组、甲基莲心碱低、中、高剂量组（2，6，10 μmol·L-1）。取对数期生长的细胞，培养于6孔板上，每孔加入2 mL培养基，培养24 h，待细胞生长至50%时，更换培养基为无血清DMEM，饥饿24 h，再更换为10%FBS的DMEM，同时加入各组药物，培养48 h，进行PCR及ELISA试验。 　　1.3 RT-PCR 细胞总RNA提取采用RNA提取试剂盒fastgen 200。逆转录采用TaKaRa方法，反应体系为10 μL，内含500 ng RNA，5×PrimeScript Buffer 2 μL，最后RNase free H2O定容到10 μL，按反应条件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s在R