黄芪对大鼠胫前肌失神经肌萎缩防治研究.docVIP

黄芪对大鼠胫前肌失神经肌萎缩防治研究 　　[摘要] 目的：研究黄芪对大鼠胫前肌失神经肌萎缩的影响，并探讨其机制。方法：建立大鼠腓总神经夹伤模型，将造模后的60只SPF级SD大鼠随机分为6组：黄芪高、中、低剂量组、弥可保组、模型组、假手术组。术后每日灌胃给药。术后18 d，病理切片染色，形态学分析，计算胫前肌湿重比与横截面积，并用实时荧光定量PCR检测Angptl4与PI3K基因的差异表达。结果：①湿重比：与模型组相比，黄芪高、中剂量组明显增高（P　　[关键词]黄芪；失神经；肌萎缩；大鼠；胫前肌；Angptl4；PI3K 　　周围神经损伤后骨骼肌因为神经营养作用的丧失及自身废用而发生萎缩[1]。由于神经再生速度的有限性和失神经肌萎缩的快速性、不可逆性，临床上延缓失神经肌萎缩的疗效仍不满意[2]。因此，如何在神经建立重新支配前防止肌肉萎缩是目前研究的热点与难题。失神经肌萎缩属于祖国医学的“痿证”范畴。病性为本虚标实。元气大伤，血脉瘀滞是其主要病理机制，益气活血法是其有效的防治方法[3]。同时近年来有研究发现[4]，黄芪可以有效延缓去神经骨骼肌的萎缩。因此，采用大鼠腓总神经夹伤模型，分别从形态学分析，测量胫前肌湿重比和横截面积等方面，进一步评价其对失神经肌萎缩的防治作用，并通过相关基因的差异表达探讨其作用机制，以期为临床治疗提供一定的理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物与分组 本实验选用SPF级雄性SD大鼠，体重200 g左右，由南京中医药大学实验动物中心提供。动物随机分为6组：黄芪高剂量组、中剂量组、低剂量组、弥可保组（阳性对照）、模型组（生理盐水组）、假手术组，每组10只动物，全部动物均经适应性喂养1周以上无异常后开始正式实验。 　　1.2 药物 黄芪煎煮后提取、浓缩成浸膏，最终浸膏浓度为4 g?g-1，黄芪含量98%，由南京中医药大学药学院制剂室制备后放入4 ℃冰箱中保存备用。弥可保，500 μg/片，卫材（中国） 药业有限公司制造（国药准字。 　　1.3 给药剂量换算及给药方法 造模后第2天开始给药，给药时间固定为每日9：00，给药剂量根据人临床使用剂量，通过每1 kg体重占有体表面积相对比值计算所得，高剂量组给临床换算剂量的2倍量，中剂量组给临床换算剂量，低剂量组给临床换算剂量的一半量。具体给药剂量如下：模型组用生理盐水4 mL灌胃；阳性对照组用弥可保（主要成分为甲钴胺）以625 mg?kg-1，终体积4 mL灌胃；黄芪高、中、低剂量组含生药25 920，12 960，6 480 mg?kg-1，各组药物均用生理盐水稀释至4 mL。 　　1.4 仪器与试剂 荧光正置显微镜（德国LEICA公司）；MP200A型电子天平（上海第一天平仪器厂）；RM2145切片机（德国LEICA公司）；ABI7500 Real-time荧光定量PCR仪、博日line-gene K FQD-48A型荧光定量PCR检测系统、美国MJ-PTC200 PCR反转录仪、DNA/RNA测定仪、Trizol RNA提取试剂（Invitrogen公司）；M-MLV反转录酶（M1705），GoTaq qPCR Master Mix（promega A6001）及dNTP为Promega公司产品；Oligo dT18，Random primer，RNase inhibitor为南京生兴生物技术有限公司产品；引物均由上海生工生物公司合成。 　　1.5 大鼠腓总神经夹伤模型制备 动物称重，以复合麻醉剂戊巴比妥钠886 mg与无水乙醇14.25 mL配置后，3 mL?kg-1腹腔注射麻醉大鼠，左股部手术区域常规备皮、消毒、铺巾。取左股后正中作1.5 cm切口，依次切开皮肤和筋膜，游离并充分暴露坐骨神经股部。向下进行腓总神经钳夹术，以14 cm止血钳，上全齿钳夹腓总神经3次，10 s/次，每次间隔10 s，挤压损伤的宽度为5 mm[5]。损伤远端以9-0无损伤缝合线作一标记，逐层缝合手术切口。全部模型由同一人，同手法操作，保持损伤程度的均一性。模型制备及术后饲养观察均在南京中医药大学实验动物中心进行，手术后动物按照不同分组而分笼饲养。 　　1.6 胫前肌湿重比的测量 术后18 d，大鼠经4%多聚甲醛灌注固定后，于胫前肌肌腹部取约1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm肌组织，立即用电子天平称量肌肉湿重，结果精确到0.01 g。称重后，计算湿重比。湿重比=手术侧胫前肌质量/非手术侧胫前肌质量。 　　1.7 胫前肌形态学观察及横截面积的测定 称重后的胫前肌，经后固定、脱水、石蜡包埋、切片（厚5 μm），肌肉Masson[6]三色染色法染色，光镜下观察各组病理组织学变化。然后每个标本选取6个切面，每个切面随机选取6个高倍镜视野，采用Leica