镰刀菌诱导结香对白木香叶内生真菌分布和群落构成影响研究.docVIP

镰刀菌诱导结香对白木香叶内生真菌分布和群落构成影响研究 　　[摘要]为了研究沉香形成前后白木香叶组织中内生真菌的分布和群落构成，采用石蜡永久制片法观察白木香叶组织显微结构，细胞化学法确定内生真菌的分布。通过改良的CTAB法对白木香进行总DNA提取，利用真核生物通用引物同时对植物和内生真菌rDNA ITS序列进行PCR扩增，构建内生真菌rDNA ITS文库，RFLP分析和序列测定，用PUAP软件进行系统发育分析，构建最大简约树。结果表明：镰刀菌诱导结香前后，白木香内生真菌菌丝主要分布于海绵组织和韧皮部，结香后韧皮部内生真菌菌丝相对丰度明显增大；茎点霉是未结香白木香叶内生真菌优势种群，刺盘孢菌是已结香白木香叶内生真菌优势种群；刺盘孢菌是未结香和已结香白木香唯一共有内生真菌，且丰度差异较大。不依赖分离培养的分子生物学方法可快速直观地用于植物组织内生真菌的鉴定。白木香叶内生真菌具有一定的遗传多样性，沉香形成前后白木香内生真菌群落构成差异较大。 　　[关键词]白木香；沉香形成；人工造香；内生真菌；rDNA ITS 　　[收稿日期]2013-05-22 　　[基金项目]国家自然科学基金项目31100496）；广东省中国科学院全面战略合作项目（2011B090300078）；广东省科技计划项目（2012A030100014） 　　[通信作者]*严寒静，副教授，Tel：（020E-mail：yanhanjing1211@163.com 　　[作者简介]高晓霞，博士，副教授，E-mail：gaoxxia91@163.com 　　白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg是瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria植物，主产于我国广东、广西和海南等地。白木香木材质地松软且不含树脂而经济价值较低，但其树干在受到损伤或刺激后会分泌一种黑色而芳香的树脂，这种包含树脂的木材即为沉香。沉香是我国、印度及其他东南亚国家传统名贵中药，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘之功效[1]。沉香还是世界上最名贵的香料之一，可用于制造香水、焚香和工艺品等。白木香是我国生产沉香的唯一植物资源，近年来，其资源遭受严重破，现已被载入《中国植物红皮书》及《国家重点保护野生植物名录》（第一批）[2-3]。 　　白木香形成沉香的机制尚不明确，但大多认为沉香是沉香树植物与真菌共同作用的产物，沉香的形成与真菌代谢有关。Burkill等于1935年首次提出沉香的形成与沉香树的免疫反应有关，是菌类攻击的结果。Bhattacharya等[4]从受侵染的沉香树中分离到Epicoccum granulatum，提出沉香树结香与真菌感染有关[5]。Gibson[6]，Tamuli[7]，Tabata[8]，Subehan[9]和戚树源等[10]等从受感染的沉香木材中分离获得的内生真菌Philophora parasitica，Pencillium citrinum，Aspergillus tamarii，Fusarium solani，Botryodiplodia theobromae，Menanotus flavolivens及其他真菌，接种于健康组织进行人工结香试验，取得一定的成功。 　　内生真菌是指在其生活史的某段时期生活于植物组织内部的，对宿主没有造成明显病害症状的真菌[11]。由于近年来研究者在药用植物中经常发现能产生与药用植物相似或相同的药用成分的内生真菌，使得药用植物内生真菌的研究备受关注[12-14]。目前对于药用植物内生真菌的分离鉴定通常采用传统的分离培养方法，再利用分子生物学手段进行菌种鉴别。不同培养基分离获得的真菌多样性存在差异，且许多真菌不能在现有的人工培养基上生长，这使得传统的分离培养方法用于研究植物内生真菌的多样性存在局限性[15-16]。王磊等[17]对不同树龄的白木香及其不同组织部位进行了内生真菌的分离培养及分子鉴定，结果表明镰刀菌是结香部位的优势种群。Gong等[18]采用培养分离技术获得白木香内生真菌128株，其中镰刀菌为优势种群且具有良好的抗菌活性。Mohamed等[19]采用培养分离技术和PCR直接测序技术分析机械损伤A. malaccensis白木和暗褐色木（结香部位）内生真菌群落构成，结果表明白木和结香部位内生真菌群落构成差异不显著，但结香部位Fusarium sp.和Lasiodiplodia sp.丰度明显高于白木。Tian等[20]采用rDNA ITS PCR克隆测序技术分析机械损伤白木香叶内生真菌的群落构成，结果表明机械损伤前后内生真菌群落构成差异较大，Colletotrichum gloeosporoides，Botryosphaeria，Cylindrocladium可